杜鵑蘭酮的制備方法研究

陳卓　譚李玉　楊月　烏雪娟　夏銳

摘????? 要：為了探究抗糖尿病性視網(wǎng)膜病變活性天然產(chǎn)物杜鵑蘭酮的制備工藝，本研究以市售可得的4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮為原料，經(jīng)縮合、氫化、芐基化及選擇性去甲基化等6步反應(yīng)，以9.6%的總收率制備了杜鵑蘭酮。最后考察了選擇性去甲基化反應(yīng)中反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度對目標產(chǎn)物得率的影響。

關(guān)? 鍵? 詞：杜鵑蘭酮;選擇性去甲基化反應(yīng);高異黃酮

中圖分類號：R9; TQ463?? ???文獻標識碼： A?? ????文章編號： 1671-0460（2020）07-1265-04

Study on Preparation of Cremastranone

CHEN Zhuo， TAN Li-yu，YANG Yue， WU Xue-juan， XIA Rui

（Xian Medical University， Xian Shaanxi 710021， China）

Abstract： In order to explore the preparation process of cremastranone， a natural product of anti-diabetic retinopathy activity， cremastranone was prepared with 4-oxyoxanoe-6-hydroxy-2， 3-dioxybenzone as raw material via six-step reactions， such as condensation， hydrogenation， benzylation，selective demethylation and so on，and the total yield was 9.6%. The effect of reaction solvent and reaction temperature on the yield of the target product was also investigated in the selective demethylation reaction.

Key words： Cremastranone; Selective demethylation reaction; Homoisoflavonoids

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，最終可導(dǎo)致不可逆的視力喪失^[1]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變的關(guān)鍵因子^[2]，是臨床藥物治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要靶點。

目前，針對VEGF通路的主要一線臨床治療藥物是抗VEGF單抗^[3]。然而，抗VEGF單抗球內(nèi)注射治療在DR治療中仍存在著一系列顯著問題：首先，由于抗VEGF單抗是分子量148 KD的蛋白質(zhì)大分子，無法經(jīng)角膜或血-視網(wǎng)膜屏障吸收入眼，必須通過玻璃體腔注射。反復(fù)的玻璃體腔注射破壞玻璃體的正常微環(huán)境^[4]，不僅給患者帶來極大的痛苦，也增加了對眼球組織的結(jié)構(gòu)損害，臨床多見眼內(nèi)感染、晶狀體損傷、高眼壓、動脈阻塞、結(jié)膜出血、玻璃體內(nèi)浮游物等。第二，非選擇性的VEGF抑制可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜正常組織結(jié)構(gòu)的萎縮^[5]。視網(wǎng)膜的多種VEGF分泌細胞中，只有視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的VEGF在DR的發(fā)展中是病理性的。而視網(wǎng)膜色素上皮細胞 （retinal pigment epithelium， RPE） 產(chǎn)生的生理性VEGF有助于維持脈絡(luò)膜微循環(huán)的正常生理狀態(tài)。VEGF單抗的非選擇性可能引起殘余正常視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的凋亡變性，并且增加了脈絡(luò)膜毛細血管循環(huán)障礙的危險^[6]。第三，抗VEGF單抗制備、純化困難，生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致價格昂貴，許多患者因而放棄治療。

因此，開發(fā)基于易制備的小分子化合物、具有高度選擇性的VEGF通路拮抗劑，如VEGF受體抑制劑，是目前的新藥研究及開發(fā)的熱點。杜鵑蘭酮（Cremastranone，結(jié)構(gòu)如圖1）是一種天然產(chǎn)物，屬于3-苯基-4-色滿酮（chromanone），或高異黃酮（homoisoflavanone），于1987年在葡萄風(fēng)信子（Muscari armeniacum）中首次發(fā)現(xiàn)^[7]，近年來在我國常見植物杜鵑蘭（Cremastra appendiculata （D.Don） Makino）中亦有發(fā)現(xiàn)^[8]，杜鵑蘭的假鱗莖入藥稱毛慈菇，錄于《本草拾遺》。

體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭酮具有顯著的新生血管抑制作用，對眼部微血管上皮細胞具有較強的選擇性抑制作用，但對眼部的其他細胞系，甚至大血管上皮細胞并未觀察到脫靶作用^[9]。在小鼠視網(wǎng)膜病變模型研究中具有良好的新生血管抑制作用，也未觀察到明顯的副作用^[10]。因此，對杜鵑蘭酮類結(jié)構(gòu)進行深入研究，有望解決上述藥物所面臨的問題。

杜鵑蘭酮屬于二甲基取代的高異黃酮類化合物，其母核上的5個羥基中僅有兩個被甲基取代，在合成過程中實現(xiàn)選擇性甲基化/去甲基化具有顯著的挑戰(zhàn)性。目前，國內(nèi)外對杜鵑蘭酮類結(jié)構(gòu)的研究較少^[11-13]，本研究對其制備方法^[11]進行了考察（圖2），尤其針對其選擇性去甲基化反應(yīng)進行了工藝改進。對于針對此類結(jié)構(gòu)的深入研究及構(gòu)效關(guān)系分析有著重要的基礎(chǔ)意義，此工藝研究目前未見文獻報道。

1? 儀器與試劑

磁力攪拌低溫槽，PSL-1810型，日本東京理化株式會社;Agilent TM 1260 型高效液相色譜儀。

4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮， 95%，上海隆盛化工有限公司;異香草醛，98%，Macklin Inc.;鈀碳，10%Pd，Macklin Inc.;N，N-二甲基甲酰胺二甲縮醛，97%，Macklin Inc.;三甲基碘硅烷，97%，含銅作穩(wěn)定劑，Macklin Inc.;芐溴，化學(xué)純，安耐吉化學(xué);柱層析所使用薄層硅膠為硅膠H，青島海洋化工;其他常見有機溶劑、試劑均為分析純，必要時干燥。

2? 杜鵑蘭酮的制備研究^[11]

2.1? 4'-芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'，3-二羥基查爾酮（化合物1）的合成研究

稱取4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮 3 g加至事先裝有溫度計及恒壓滴液漏斗的三頸瓶中，向三頸瓶中用量筒加入 30 mL 無水乙醇，攪拌至完全溶解。稱取事先無水處理過的KOH 0.67 g，攪拌混勻。稱取異香草醛 1.6 g，以40 mL無水乙醇溶解后，通過恒壓滴液漏斗緩緩滴加至反應(yīng)液中， 滴加完畢通入氮氣保護，加熱攪拌至回流開始計時，反應(yīng)12 h。 反應(yīng)結(jié)束后，靜置冷卻至室溫。濾去不溶物，濾液減壓濃縮至約20 mL左右，抽濾，濾餅用10 mL無水乙醇洗滌，濾液繼續(xù)濃縮至干。所得油狀物用乙酸乙酯溶解，依次用5%鹽酸、飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸干。所得黑色油狀物以硅膠柱層析法（環(huán)己烷∶乙酸乙酯3∶1至1∶1）純化，得到產(chǎn)物黃色油狀物2.02 g，產(chǎn)率46.3%，經(jīng)核磁共振波譜法驗證為4'-芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'，3-二羥基查爾酮（化合物1），¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ 8.07 （s， 1H），7.21～7.43 （m， 9H），6.29 （s， 1H）， 5.19 （s， 1H），3.81 （d， 6H），3.74 （s， 3H）。

2.2 ?2'，3'，4-三甲氧基-4'，6'，3-三羥基二氫查爾酮（化合物2）的合成向100 mL 厚壁圓底燒瓶中依次加入化合物

1 1.09 g，鈀碳0.7 g，無水乙醇30 mL，安裝三通換氣閥。以氮氣置換體系中的空氣3次后，檢漏。以配置減壓閥的氫氣瓶將體系內(nèi)氮氣置換為氫氣，最終維持在約0.1 MPa的內(nèi)壓下，室溫下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液小心地常壓過濾以回收鈀碳，濾餅用30 mL無水乙醇分多次洗滌，濾液濃縮至干。所得紅棕色膠狀物以硅膠柱層析法（環(huán)己烷∶乙酸乙酯3∶1至1∶1）純化，得到產(chǎn)物黃色油狀物0.65 g，產(chǎn)率74.9%，經(jīng)核磁共振波譜法驗證為4'，3-二芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'-羥基二氫查爾酮（化合物3），¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ 9.62 （br， 1H），6.72 （s， 1H），6.59 （s， 2H），6.07 （s， 1H），3.88 （s， 3H），3.86 （s， 3H），3.61 （s， 3H），2.61 （t， 2H），2.52 （t， 2H）。

2.3? 4'，3-二芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'-羥基二氫查爾酮（化合物3）的合成

向裝有溫度計及恒壓滴液漏斗的三頸瓶中加入0.7 g化合物2及碳酸鉀0.83 g，丙酮30 mL。將此反應(yīng)裝置置于磁力攪拌低溫槽中，低溫槽溫度設(shè)為-3 ℃。攪拌均勻后，從恒壓滴液漏斗中滴加0.82 g芐溴。滴畢，轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌2 h，升溫至回流反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，靜置冷卻至室溫，倒入水中以去除芐溴。將該混合物減壓蒸去丙酮，以乙酸乙酯50 mL分3次提取殘余水溶液，乙酸乙酯層合并后依次用飽和碳酸鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸干。所得黑色油狀物以硅膠柱層析法（環(huán)己烷∶乙酸乙酯10∶1至2∶1）純化，得到產(chǎn)物褐色固體0.75 g，產(chǎn)率71.4%，經(jīng)薄層色譜法初步證實后，用于下步反應(yīng)。

2.4 ?5，6，4'-三甲氧基-7，3'-羥基二氫高異黃酮（化合物4）的合成

向50 mL 厚壁圓底燒瓶中依次加入0.53 g化合物3，0.24 g DMF-DMA，甲苯30 mL，攪拌溶解后，安裝冷凝管，加熱至回流反應(yīng)6 h。

冷卻至室溫后，向體系投入鈀碳0.2 g，安裝三通換氣閥。以氮氣置換體系中的空氣3次后，檢漏。以配置減壓閥的氫氣瓶將體系內(nèi)氮氣置換為氫氣，最終維持在約0.1 MPa的內(nèi)壓下，室溫下攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液小心地常壓過濾以回收鈀碳，濾餅用30 mL甲苯分多次洗滌，濾液濃縮至干。所得紅棕色膠狀物以硅膠柱層析法（環(huán)己烷∶乙酸乙酯1∶1）純化，得到產(chǎn)物黃色油狀物198 mg，產(chǎn)率54.9%。經(jīng)核磁共振波譜法驗證為化合物4，¹H-NMR （400 MHz，CD₃OD） δ 6.79 （d， J =9.6Hz，1H），6.69 （s，1H），6.66 （dd，1H），6.21 （s，1H），4.34 （dd，J=7.6， 2.8Hz，1H），4.19 （dd，J=7.6，2.4 Hz，1H），3.77 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H），3.62 （s， 3H），2.93 （dd，J=8.6，2.3Hz，1H），2.67 （m，1H），2.51 （dd，J =9.6，7.2Hz，1H）。

2.5 ?杜鵑蘭酮的合成

將72 mg化合物4加入10 mL圓底燒瓶中，加入氯仿2 mL，攪拌溶解，將此反應(yīng)裝置置于磁力攪拌低溫槽中，低溫槽溫度設(shè)為-10 ℃。于攪拌下向反應(yīng)液中滴入碘代三甲硅烷 90 mg的4 mL氯仿溶液。滴畢，保持在低溫槽中攪拌10 min，然后將反應(yīng)體系溫度上升到室溫反應(yīng)1 h，薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入10 mL甲醇中。減壓蒸餾，剩余物以30 mL氯仿溶解后，分別用亞硫酸氫鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸干。所得黑色油狀物以硅膠柱層析法（環(huán)己烷∶乙酸乙酯2∶1至1∶1）純化，得到產(chǎn)物褐色固體48.6 mg，產(chǎn)率70.3%。經(jīng)核磁共振波譜法驗證為目標產(chǎn)物杜鵑蘭酮，¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD）δ 7.02 （d， J =5.8 Hz，1H），6.87 （s，1H），6.64 （m， 1H），5.89 （s， 1H），4.47 （dd， J=7.6，2.8 Hz，1H），4.11 （dd， J=7.6，4.8 Hz，1H），4.01 （s， 3H）， 3.93 （s， 3H），3.14 （dd， J=9.2，3.2 Hz， 1H），2.78 （m， 1H），2.50 （dd， J=9.2，3.2 Hz ，1H）。

3? 杜鵑蘭酮制備中選擇性去甲基化工藝探索

在杜鵑蘭酮的合成中，其7位羥基可以通過芐基進行保護，并在制備過程中通過氫化反應(yīng)脫去芐基。然而，5位羥基從起始原料4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮開始，在制備過程中始終被甲基保護，最終如何在不影響6，4'位的兩個甲氧基的情況下，選擇性地斷開醚鍵，脫去5位羥基上的甲基，是杜鵑蘭酮制備過程中的重要科學(xué)問題。

筆者考察了在該選擇性去甲基化反應(yīng)中反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度對目標產(chǎn)物得率的影響。

考察反應(yīng)溶劑對選擇性去甲基化反應(yīng)收率的影響時，考察了質(zhì)子溶劑、非質(zhì)子極性溶劑、中等極性溶劑及低極性溶劑等體系，考察結(jié)果如表1、表2。

考察反應(yīng)溫度對選擇性去甲基化反應(yīng)收率的影響時，采用氯仿為溶劑，考察結(jié)果如下。

從表1及表2中可以看出， 化合物4的最佳選擇性去甲基化反應(yīng)條件為以氯仿為溶劑，室溫下反應(yīng)。

4? 結(jié)束語

本研究以碘代三甲硅烷作為去甲基化試劑，在溫和的條件下實現(xiàn)了杜鵑蘭酮5位的選擇性去甲基化。該選擇性的實現(xiàn)，可能是由于該甲氧基旁邊4，6位的羰基和甲氧基的位阻效應(yīng)，迫使該甲氧基略離開了苯環(huán)平面，使該甲氧基的氧原子無法與苯環(huán)共軛，氧無法接受苯環(huán)電子云的共軛效應(yīng)，電負性增加，從而易接受親電進攻。在研究中，我們考察反應(yīng)溫度時發(fā)現(xiàn)，在較高溫度下難以實現(xiàn)更高的收率，可能是因為在較高的溫度下，其他甲氧基上氧原子的反應(yīng)活性提高了，難以實現(xiàn)區(qū)域選擇性的緣故。

本研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化反應(yīng)的最適合溶劑為氯仿，采用其他質(zhì)子溶劑、非質(zhì)子極性溶劑、低極性溶劑均無法獲得較好的結(jié)果。這可能是因為該反應(yīng)機理為先生成離子化的碘化鎓鹽中間體，該鎓鹽再生成硅氧烷中間體，這一步反應(yīng)為較慢的限速步驟。因此，可以合理推測^[14-15]，在極性溶劑中鎓鹽得到了較好的溶劑化，使其參與的反應(yīng)的活化能壘提高，不利于反應(yīng)的進行。當(dāng)使用低極性的甲苯作為溶劑時，收率降低可能是因為鎓鹽中間體的溶解性問題或區(qū)域選擇性較差導(dǎo)致的，該原因有待在后續(xù)研究中進一步探討。

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基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目（項目編號：19JK0772）;西安醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（項目編號：2018DC-32，

2018DC-75）。

收稿日期：2020-04-04

作者簡介：陳卓，男，副教授，研究方向：新藥開發(fā)。E-mail：chenzhuo_chem@outlook.com。