基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的血府逐瘀湯治療大鼠顱腦損傷的血漿代謝組學研究

范 帆，張志敏，盧紅梅

(中南大學 化學化工學院，湖南 長沙 410083)

顱腦損傷是因外力作用于頭部而造成的腦組織損傷，具有較高的病死率和致殘率[1-3]。血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，由生地、川芎、赤芍、桃仁、紅花、枳殼、甘草、當歸、牛膝、桔梗、柴胡組成，該方劑具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，廣泛用于治療心腦血管病、腦外傷等[4-7]。

代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后興起的一個系統(tǒng)生物學新分支，研究在外界刺激、干擾或自身病理生理條件下代謝組的動態(tài)變化規(guī)律[8-9]?；诂F(xiàn)代分析技術(shù)，借助于化學計量學等數(shù)據(jù)處理方法，可以從代謝組學得到多維的、復雜的數(shù)據(jù)中挖掘出隱藏的化學、生物信息，最終達到代謝組學分析研究的目的[10-11]。

本實驗采用前期建立的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法[12]，對假手術(shù)組和模型組大鼠血漿的代謝物進行定性定量分析，然后以t檢驗(t-test)、有監(jiān)督的正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)篩選出的具有顯著差異的代謝物為潛在標志物，并觀察其在治療組中的時序變化。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QP2010型GC-MS(日本島津公司)，配Shimadzu-GL自動進樣器；甲醇(色譜純，Merck公司)；2-異丙基蘋果酸、甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(分析純，Sigma-Aldrich公司)。

1.2 樣本信息

實驗樣本為大鼠顱腦損傷模型的血漿樣本，共148例。動物模型的建立和血漿樣本的采集由中南大學湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科協(xié)助完成。樣本分為治療組、模型組、假手術(shù)組。假手術(shù)組的大鼠通過手術(shù)磨除骨窗，不予打擊。模型組和治療組大鼠采用相同高度、相同質(zhì)量的自由落體打擊，從而構(gòu)建顱腦損傷大鼠模型。治療組在造模后給予血府逐淤湯灌胃，模型組、假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃，分別收集各組灌胃后第1、3、7、14 d的血漿樣本。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本預(yù)處理將100 μL血漿樣本于4 ℃解凍30 min，加入30 μL 2-異丙基蘋果酸(1 mg/mL，IS,內(nèi)標溶液)、300 μL甲醇，渦旋30 s。4 ℃下以16 000 r/min離心10 min。取離心后的上清液330 μL，常溫下用氮氣吹干。殘渣加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，渦旋60 s后用封口膜封口，于70 ℃水浴反應(yīng)1 h，進行第1次衍生反應(yīng)。加入100 μL BSTFA衍生試劑，渦旋60 s后用封口膜封口，于70 ℃水浴反應(yīng)1 h，進行第2次衍生反應(yīng)。冷卻至室溫，取上清液，供GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析條件色譜柱為Agilent DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度70 ℃，保持4 min，以8 ℃/min升至300 ℃，保持3 min，色譜出峰時間為6.5 min，總運行時間35.75 min。進樣口溫度為280 ℃，分流比10>∶1。載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進樣量為1 μL。質(zhì)譜采用EI源，電子轟擊電壓70 eV；離子源溫度250 ℃，接口溫度280 ℃，檢測電壓0.9 kV，以0.2 s/scan的間隔進行全掃描，掃描的質(zhì)量范圍(m/z)為35～800 amu。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析采用NIST/EPA/NIH質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對樣本定性。以內(nèi)標法定量，代謝物的相對濃度用均值±標準偏差表示。利用t檢驗對模型組及假手術(shù)組的第1、3、7、14 d的代謝組進行統(tǒng)計檢驗，將具有顯著性差異的代謝物作為潛在標志物。采用PCA和OPLS-DA觀察模型組和假手術(shù)組的總體差異。綜合變量的投影重要性指標(VIP)及t檢驗結(jié)果篩選生物標志物。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝物的定性定量分析

對所有血漿樣本進行GC-MS分析，采用NIST譜庫共鑒定出43種化合物，包括丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸等氨基酸，半乳糖、葡萄糖等糖類，棕櫚酸、亞油酸等脂肪酸類，以及尿素、磷酸等小分子代謝物(表1)，由所有測試樣本等量混合而成的質(zhì)控樣本(QC)的代表性總離子流圖見圖1。

表1 顱腦損傷模型組、假手術(shù)組血漿樣本定性定量及t檢驗結(jié)果Table 1 Qualitative,quantitative analysis and t-test results of plasma samples of model group and sham group

2.2 模型組與假手術(shù)組差異代謝物篩選

將模型組與假手術(shù)組的數(shù)據(jù)上傳至Metabo Analyst 4.0平臺(Http://metaboanalyst.ca)，以p值小于0.05判斷該代謝物在兩個樣本集間是否存在顯著差異。結(jié)果顯示，13種代謝產(chǎn)物在模型組和假手術(shù)組之間存在顯著性差異(表1)，其中油酸、色氨酸、亞油酸、乳酸、棕櫚酸等11種代謝物p值小于0.001。這表明顱腦損傷會引起血漿代謝組顯著變化。

運用PCA對第1、3、7、14 d的模型組及假手術(shù)組的代謝組進行分析(圖2)，圖中圓圈代表假手術(shù)組樣本，方塊代表模型組樣本，置信區(qū)間為95%。由圖可見模型組和假手術(shù)組代謝的整體模式上有一定的分離趨勢，但由于存在干擾組分以及PCA的投影方向為方差最大方向，PCA投影圖中組間的區(qū)分度不夠明顯。

圖1 QC樣本的GC-MS總離子流圖Fig.1 Typical total ion chromatogram(TIC) of QC plasma samplethe peak number 1-43 were the same as those in Table 1

圖2 PCA分類模型圖Fig.2 PCA classification model diagram

OPLS-DA判別分析融合了正交信號校正的干擾信息剔除能力以及偏最小二乘判別的相關(guān)信息提取能力，是代謝組學中最常用的建模方法。模型組及假手術(shù)組的OPLS-DA分析結(jié)果如圖3A所示，可見兩組有較好的分離效果。經(jīng)過200次置換檢驗，模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象(圖3B)。OPLS-DA分析結(jié)果顯示模型組和假手術(shù)組在整體代謝模式上存在顯著差異。同時引入該模型的VIP圖探究分類的貢獻變量指標。由圖4可知，有16個變量的VIP>1。選取顱腦損傷模型組與假手術(shù)組t檢驗結(jié)果中p<0.05且OPLS-DA模型中VIP>1的代謝物為差異代謝物，最終確定乳酸、組氨酸、棕櫚酸、色氨酸、亞油酸、油酸、硬脂酸為兩組的差異代謝物。

2.3 第14 d的治療組與假手術(shù)組代謝組的差異倍數(shù)分析

對第14 d治療組與假手術(shù)組的代謝組進行差異倍數(shù)分析，將差異倍數(shù)分析(FC)的閾值設(shè)為2，將對比式設(shè)為治療組/假手術(shù)組,由圖5可知，除丙二酸外，其他代謝物的log2FC均在[-1,1]區(qū)間內(nèi)且主要集中在橫軸附近(圖5)，表明除治療組中丙二酸含量顯著低于假手術(shù)組外，其他代謝物在兩組中的相對濃度無顯著性倍數(shù)差異，即第14 d治療組的代謝組整體上接近假手術(shù)組。丙二酸是三羧酸循環(huán)重要的中間產(chǎn)物，治療組中丙二酸含量的降低可能與有氧代謝增強，中間產(chǎn)物含量降低有關(guān)。

圖4 模型組與假手術(shù)組OPLS-DA 模型變量投影重要度圖Fig.4 VIP values plot from OPLS-DA based on plasma profiling of the model vs.sham groups

圖5 第14 d的治療組與假手術(shù)組代謝組的差異倍數(shù)分析Fig.5 Fold change analysis of the treatment group and the sham group on day 14

2.4 差異代謝物在治療組中的時序變化

綜合t檢驗結(jié)果及VIP值的重要性排序，選取乳酸、組氨酸、棕櫚酸、色氨酸、亞油酸、油酸、硬脂酸為生物標志物，觀測其在治療組中的時序變化(圖6)。結(jié)果顯示，治療組中乳酸、組氨酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸的相對濃度在第1 d最高，隨著治療逐漸降低。色氨酸的相對濃度呈先減后增的趨勢，治療第3 d相對濃度最低。油酸的相對濃度呈先增后減的趨勢，相對濃度在治療第3 d最高。以上代謝物的相對濃度在治療的第14 d均與假手術(shù)組的值接近。

圖6 乳酸(A)、組氨酸(B)、色氨酸(C)、棕櫚酸(D)、亞油酸(E)、油酸(F)、硬脂酸(G)在治療組中的時序變化Fig.6 Temporal changes of lactic acid(A),histidine(B),tryptophan(C),palmitic acid(D),linoleic acid(E),oleic acid(F),stearic acid(G) in the treatment groupM:stands for the method group;T1,T3,T7,T14 were the treatment group on day 1,3,7,14;S:represents the sham group

據(jù)文獻報道，顱腦損傷可引起腦組織缺血、缺氧，繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)上調(diào)，致使神經(jīng)元凋亡壞死[13]；而代謝物的相對濃度在第1 d或第3 d出現(xiàn)最值，可能與顱腦損傷后大腦廣泛存在凋亡現(xiàn)象有關(guān)，傷后第1 d即出現(xiàn)凋亡細胞，傷后第3 d細胞凋亡達到高峰[14]。顱腦損傷幾分鐘后，線粒體功能障礙，細胞呼吸作用受阻。為滿足能量需求，厭氧糖酵解將會增加，并導致乳酸積累[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠用藥第1 d血漿中乳酸濃度最高，經(jīng)血府逐瘀湯治療，乳酸濃度整體呈下降趨勢，并在第14 d與假手術(shù)組中乳酸濃度接近，這表明血府逐瘀湯可改善腦部缺血缺氧狀況，調(diào)節(jié)神經(jīng)組織能量代謝。組氨酸能夠誘發(fā)高膽固醇血癥，且其在組氨酸脫羧酶的作用下脫羧形成組胺，而組胺可舒張血管，增加血管管壁的通透性，從而導致局部水腫，因此組氨酸和體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)[16]。色氨酸是一種限制性氨基酸，與免疫蛋白的合成密切相關(guān)，主要通過調(diào)節(jié)淋巴細胞和合成免疫球蛋白提高機體免疫力[17-18]。當機體發(fā)生炎癥時，色氨酸分解代謝會增強。同時，色氨酸也是血清素神經(jīng)遞質(zhì)的前體，血漿中色氨酸濃度的正?；瘯黾由彼釋δX部的供應(yīng)[19]，從而為中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供能量和合成蛋白質(zhì)，進而促進認知功能的恢復[20]。由圖5C可知，炎癥發(fā)生后第3 d色氨酸含量最低，此后隨著炎癥減輕，色氨酸的相對濃度逐漸升高，再次證明血府逐瘀湯對減輕顱腦損傷引發(fā)的炎癥具有治療效果。顱腦損傷后脂代謝紊亂，血漿中脂類的增多使血液黏度增加形成血瘀。棕櫚酸是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要組成成分，研究顯示棕櫚酸與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等具有相關(guān)性[21-22]。也有研究表明硬脂酸能夠拮抗氧化應(yīng)激造成的腦片損傷，起到神經(jīng)保護作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)治療組中棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸的含量在第1 d或第3 d最高，隨后均降低，表明血府逐瘀湯具有活血化瘀調(diào)節(jié)脂代謝的作用。

文獻采用氫譜核磁共振(1H NMR)技術(shù)研究了血府逐瘀湯對大鼠腦損傷的修復機理[24]，發(fā)現(xiàn)治療組血漿中乳酸、谷氨酸、膽堿的含量低于模型組，而N-乙酰天門冬氨酸、γ-羥基丁酸、肌酸的含量升高。本研究結(jié)果則顯示，治療組血漿中乳酸、組氨酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸的相對濃度逐漸降低，油酸的相對濃度先升高后降低，色氨酸的相對濃度先降低后增加。這從一定程度上反映了GC-MS和1H NMR在代謝組學研究中的互補性。同時也提示，對于非靶標代謝組學研究，在實驗條件允許的情況下，最好同時采用1H NMR和MS技術(shù)表征代謝組，以獲得覆蓋率更高的代謝物，用于標志物的篩選，方便獲得更為全面可靠的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合t檢驗和OPLS-DA，采用GC-MS對大鼠顱腦損傷模型組、治療組以及假手術(shù)組的血漿代謝組進行定性定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組和假手術(shù)組血漿代謝存在明顯差異，并篩選出乳酸、組氨酸、棕櫚酸、色氨酸、亞油酸、油酸、硬脂酸7種差異代謝物，以此為潛在標志物，觀察7種代謝物在藥物治療組中的時序變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血府逐瘀湯治療后差異代謝物含量逐漸趨近于假手術(shù)組。研究結(jié)果表明，血府逐瘀湯對顱腦損傷具有良好的治療作用，上述7種代謝物可作為生物標志物來觀察顱腦損傷患者的恢復情況及治療效果，該研究可為血府逐瘀湯治療顱腦損傷的臨床研究提供一定的科學支撐。