天麻素對(duì)阿爾茨海默病小鼠的腦內(nèi)氧化應(yīng)激及tau蛋白磷酸化的影響

張浩 邊詩(shī)宇 高飛 王英濱

[摘要] 目的 研究天麻素對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激及tau蛋白磷酸化水平的影響。 方法 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、AD模型組（tau 轉(zhuǎn)基因小鼠）和天麻素治療組，治療組小鼠選取tau轉(zhuǎn)基因小鼠，隔日給予天麻素[5 mg/（kg·d）]灌胃處理3個(gè)月，對(duì)照組和模型組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠）則均給予生理鹽水灌胃處理。通過(guò)分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)相關(guān)技術(shù)檢測(cè)各組小鼠腦內(nèi)p-tau202磷酸化水平及CHAT的表達(dá);并考察氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化。 結(jié)果 Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示，模型組小鼠腦內(nèi)p-tau202的表達(dá)高于對(duì)照組小鼠，而天麻素治療組小鼠腦內(nèi)p-tau202的表達(dá)水平較模型組小鼠降低;氧化應(yīng)激結(jié)果顯示，天麻素干預(yù)處理后，小鼠腦內(nèi)的MDA含量降低，SOD活性明顯升高;Western blot結(jié)果顯示，與模型組小鼠相比較，天麻素治療組小鼠腦內(nèi)CHAT表達(dá)水平降低。 結(jié)論 天麻素能夠通過(guò)減少氧化應(yīng)激進(jìn)而降低AD模型小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平，最終起到對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 天麻素;阿爾茨海默病;tau蛋白磷酸化;氧化應(yīng)激;保護(hù)作用

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）17-0033-04

The effect of gastrodin on oxidative stress and tau protein phosphorylation in the brain of the mice with Alzheimer's disease

ZHANG Hao1? ?BIAN Shiyu2? ?GAO Fei1? ?WANG Yingbin1

1.Department of Neurosurgery，Division Ⅱ，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang? ?110024，China;2.Biotechnology Major，China Medical University，Shenyang? ?110024，China

[Abstract] Objective To mainly study the effect of gastrodin on oxidative stress（OS） and tau protein phosphorylation in the brain of the AD model mice. Methods In the experiment，the subjects were divided into the normal control group，the AD model group（tau transgenic mice）and the gastrodin intervention group. Tau transgenic mice were selected into the intervention group， which received gastrodin[5 mg/（kg·d）] in the form of intragastric administration every other day for 3 m， while normal saline was administrated in intragastric form to the mice in the control group and the AD model group（tau transgenic mice）. The p-tau202 phosphorylation level and the expression of CHAT in the brain of each group of mice were detected by the relevant techniques of molecular biology and morphology， and the changes of OS related indexes were also investigated. Results Western blot and immunofluorescence results showed that the p-tau202 expression in the brain of tau transgenic mice was higher than that in the brain of the mice in the control group， while the p-tau202 expression level in the brain of the mice in the gastrodin intervention group was lower than that of tau transgenic mice. OS results showed that after gastrodin intervention， MDA content in the brain of the mice decreased and SOD activity significantly increased. Western blot results showed that compared with that of the mice in the AD model group，the CHAT expression level in the brain of the mice in the gastrodin intervention group decreased. Conclusion Gastrodin can reduce the phosphorylation level of tau protein in the brain of AD model mice by reducing OS，and ultimately play a protective role on neurons.

[Key words] Gastrodin; Alzheimer's disease（AD）; Tau protein phosphorylation; Oxidative stress（OS）; Protective role

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是由德國(guó)學(xué)者Alois Alzheimer發(fā)現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，迄今為止已有100多年的研究歷史[1-2]。如今，AD發(fā)病率逐年上升，并已成為世界上最常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型[3-4]。AD的主要病理特征主要體現(xiàn)在兩方面：①大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核和丘腦中出現(xiàn)大量β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β，Aβ）沉積形成的老年斑（Senile plaque，SP）;②大腦皮質(zhì)和海馬存在大量由tau蛋白過(guò)度磷酸化進(jìn)而形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFTs）[5-7]。AD發(fā)病的確切原因尚不清楚，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病因與多種因素有關(guān)。研究表明，氧化應(yīng)激損傷參與AD的發(fā)病過(guò)程，并在AD發(fā)病機(jī)制的眾多學(xué)說(shuō)中，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)與其他諸多假說(shuō)之間存在間接或直接的聯(lián)系。

天麻素（Gastrodin/gastrodine，GAS）是中藥天麻塊莖的主要成分之一。研究表明，GAS在鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化自由基等多方面功效明顯，令人感興趣的是，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GAS不僅能夠保護(hù)神經(jīng)元，而且還可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少 Aβ老年斑沉積，有效改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙[8-9]。上述結(jié)果證實(shí)GAS在AD防治方面具有重要的理論意義，但GAS對(duì) AD小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響及其作用途徑和機(jī)制目前尚未清楚。

為此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3月齡tau 轉(zhuǎn)基因小鼠，采用相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)天麻素對(duì)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平的影響，并考察各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，最后通過(guò)Western blot方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)CHAT的表達(dá)，有望將天麻素作為防治AD的新靶點(diǎn)，為延緩AD發(fā)病進(jìn)程奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品? 天麻素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-18030827），CHAT（abcam，貨號(hào)：ab181023），β-actin（Cell Signaling Technology，貨號(hào)：4970s），鼠抗tau（Cell Signaling Technology，貨號(hào)：4019s）、兔抗p-tau Ser 202（Cell Signaling Technology，貨號(hào)：39357s），ECL試劑盒（Pierce，CA貨號(hào)：BTB320098），熒光二抗（ThermoFisher，貨號(hào)：A-11037），蛋白marker（ThermoFisher，貨號(hào)：26616），丙二醛（MDA）試劑盒（齊一生物科技有限公司，貨號(hào)：QYS-23035），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（齊一生物科技有限公司，貨號(hào)：JK5301）。

1.1.2 主要儀器? 離心機(jī)（美國(guó)Beckman Allegra X-30R），水平搖床（捷星實(shí)驗(yàn)儀器），Bio-RAD酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad iMark），BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad ChemiDoc XRS+），臺(tái)式高速離心機(jī)（Genespeed），激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司TCS SP8）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 3月齡tau轉(zhuǎn)基因小鼠（Stock Number 008169）和C57BL/6由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室提供。體重為15～22 g，實(shí)驗(yàn)所用小鼠均按照組別分籠飼養(yǎng)，每籠3只，自由飲食水，動(dòng)物房的室內(nèi)溫度保持在20°C～25°C。

1.1.4 動(dòng)物分組及給藥處理? ?稱(chēng)取 200 mg天麻素于高壓過(guò)的 EP 管中，向其中加入1 mL的生理鹽水溶解，使其終濃度為 200 mg/mL備用。

小鼠出生后1個(gè)月，提取鼠尾DNA，PCR鑒定出tau轉(zhuǎn)基因小鼠，同時(shí)，通過(guò)剪指甲的方式將小鼠標(biāo)記序號(hào)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字分為AD模型組（tau轉(zhuǎn)基因小鼠）和天麻素治療組（tau轉(zhuǎn)基因小鼠+天麻素干預(yù)），每組小鼠隨機(jī)選取15只，同背景同月齡C57BL/6小鼠15只，設(shè)為正常對(duì)照組。具體給藥方式如下所示：對(duì)照組和tau轉(zhuǎn)基因組小鼠，隔日給予生理鹽水灌胃處理;天麻素治療組小鼠，將tau轉(zhuǎn)基因小鼠按隔日給予5 mg/（kg·d）天麻素灌胃，時(shí)間均為3個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腦組織取材? 每組小鼠CO2吸入麻醉，仰放在灌流操作臺(tái)上，剪去胸腹部的皮毛，采用生理鹽水心臟灌流，灌流完成后，迅速斷頭并用手術(shù)鑷子剝離小鼠頭骨，剝離出小鼠大腦，將完整的小鼠大腦分成左右兩部分，其中一半大腦常規(guī)制備冰凍切片，用于形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn);另一半大腦用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 Western blot? 取各組小鼠大腦海馬組織，加入組織重量10倍的蛋白裂解液，超聲裂解，之后放于冰上繼續(xù)裂解1.5 h，低溫下15 000 g離心20 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白分裝后置于-80℃保存。電泳過(guò)程：濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，蛋白樣品加樣后，進(jìn)行凝膠電泳，電泳條件為90 V，約15 min，之后調(diào)至120 V，直至溴酚藍(lán)指示劑到凝膠底部。轉(zhuǎn)膜過(guò)程：轉(zhuǎn)印液為1×Transfer buffer，按順序放入轉(zhuǎn)印板陽(yáng)極-海綿-濾紙兩張-PVDF膜-分離膠-濾紙兩張-海綿-轉(zhuǎn)印板陰極，轉(zhuǎn)印板置于電泳槽中，加入冰盒，120 V，轉(zhuǎn)膜2 h。p-tau 202或CHAT抗體（1：3300）4°C孵育過(guò)夜，1×TBST沖洗5 min×3次，二抗室溫下孵育1 h，1×TBST沖洗5 min×4次，ECL發(fā)光，Kodak-XAR 膠片曝光，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.2.3免疫熒光染色和共聚焦激光掃描顯微術(shù)? 組織通過(guò)4%多聚甲醛固定，30%蔗糖沉糖，于冰凍切片機(jī)切片。制備出的冰凍切片于室溫下自然晾干，在腦組織周?chē)媒M化筆畫(huà)圈，dd H2O水化5 min，0.01 M PBS沖洗5 min×3次，血清封閉1 h，之后0.01 M PBS沖洗5 min×3次，一抗（1：100）4℃孵育過(guò)夜，熒光二抗分別孵育1 h，注意實(shí)驗(yàn)過(guò)程要避光，0.01 M PBS沖洗10 min×4次，滴加防熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察染色效果，并于40×鏡下拍照（標(biāo)尺長(zhǎng)度50 μm）。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)? 小鼠腦組織SOD活性及MDA含量測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對(duì)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平的影響

Tau蛋白異常磷酸化是AD主要的病理學(xué)改變之一。實(shí)驗(yàn)中，給予tau轉(zhuǎn)基因小鼠天麻素治療后，應(yīng)用免疫熒光觀察小鼠海馬CA3區(qū)p-tau 202磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠）大腦海馬CA3區(qū)p-tau 202的表達(dá)明顯增加，整合光密度分析顯示，其值分別為（0.053±0.010）和（0.116±0.009）;與模型組小鼠比較，天麻素治療組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠+天麻素）腦內(nèi)p-tau 202磷酸化水平減少，整合光密度值為（0.052±0.011）（P<0.05），見(jiàn)封三圖7A。應(yīng)用Western blot分別對(duì)三組小鼠大腦海馬p-tau 202 表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，模型組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠）腦內(nèi)p-tau 202的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組小鼠，而天麻素治療組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠+天麻素）腦內(nèi)tau蛋白在202位點(diǎn)的磷酸化水平較模型組小鼠有所降低，三組小鼠WB灰度值分析的數(shù)值分別為（100±0）、（406.0±15.1）和（174.0±18.0）（P<0.05），見(jiàn)封三圖7B。

2.2天麻素對(duì)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

通過(guò)對(duì)三組小鼠腦內(nèi)MDA含量和SOD活性的檢測(cè)考察天麻素對(duì)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。同對(duì)照組小鼠相比較，模型組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠）腦內(nèi)SOD活性下降，MDA含量明顯升高;天麻素治療后，治療組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠+天麻素）腦內(nèi)SOD活性升高，MDA含量有所降低，見(jiàn)表1。

2.3 天麻素對(duì)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的保護(hù)作用

為了探討天麻素是否能夠?qū)au轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元起到保護(hù)作用，本研究采用分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法考察了各組小鼠腦內(nèi)CHAT的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，與模型組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠）相比，天麻素治療組小鼠（tau轉(zhuǎn)基因小鼠+天麻素）腦內(nèi)CHAT的表達(dá)顯著降低，WB灰度值分析顯示，三組小鼠的數(shù)值分別為（100±0）、（344.0±15.9）和（167.0±33.5）（P<0.05），見(jiàn)圖1。上述結(jié)果說(shuō)明天麻素可以保護(hù)tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元。

注：Western blot方法考察各組小鼠腦內(nèi)CHAT的表達(dá)變化。與野生對(duì)照組小鼠相比，*P<0.05;與模型組小鼠相比，#P<0.05

3 討論

AD的神經(jīng)病理學(xué)改變之一是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)tau蛋白異常磷酸化而引起的NFTs[6]。健康人的腦內(nèi)，tau蛋白的主要作用是與神經(jīng)元微管結(jié)合并可以調(diào)節(jié)微管的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)，通過(guò)與多種蛋白間相互作用行使如維持突觸可塑性及軸漿運(yùn)輸?shù)戎匾纳碜饔肹10-11]。然而，在AD患者腦內(nèi)，tau蛋白發(fā)生異常磷酸化，這種過(guò)度的磷酸化可導(dǎo)致tau蛋白喪失上述生理功能，引發(fā)神經(jīng)元軸突退化，最后聚集形成成對(duì)的螺旋絲，即所謂的神經(jīng)元纖維纏結(jié)[12]。研究顯示，在AD發(fā)病早期，患者腦內(nèi)的tau蛋白磷酸化水平明顯高于正常人水平[13]。上述的神經(jīng)元病理改變會(huì)影響其突觸發(fā)揮正常的生理功能，并最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)及記憶功能的喪失[14-15]，因此，tau蛋白異常磷酸化在AD病變的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

AD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的重要原因之一，而且，在神經(jīng)元損傷之前氧化應(yīng)激就已經(jīng)發(fā)生。其作用機(jī)制主要體現(xiàn)在氧自由基的產(chǎn)生增多和氧自由基清除障礙等兩方面，在上述機(jī)制的作用下，腦組織極易受到氧自由基的攻擊，進(jìn)而誘發(fā)或加重疾病。文獻(xiàn)顯示，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量氧化自由基參與老年斑的產(chǎn)生及神經(jīng)元纖維纏結(jié)的過(guò)程，這些自由基能夠使一些生物大分子發(fā)生過(guò)氧化，引起神經(jīng)元凋亡，最終引發(fā)學(xué)習(xí)記憶功能的喪失[16]。也有文獻(xiàn)證實(shí)，Aβ老年斑介導(dǎo)自由基的攻擊過(guò)程，同時(shí)氧化應(yīng)激也能夠促進(jìn)老年斑的形成[17];此外，神經(jīng)元纖維纏結(jié)中存在有大量的過(guò)氧化產(chǎn)物，tau蛋白被這種過(guò)氧化產(chǎn)物修飾后更易磷酸化，進(jìn)而加重AD的發(fā)病。同時(shí)，作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志性產(chǎn)物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）也發(fā)生明顯的變化。由此可見(jiàn)，氧化應(yīng)激與AD的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。

天麻素是中藥天麻塊莖的主要成分之一，藥理學(xué)研究提示，天麻素具有重要的抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡作用，還能夠改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。文獻(xiàn)報(bào)道，天麻素可通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路，下調(diào)炎癥蛋白iNOS表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用;此外，天麻素還可以通過(guò)激活p38 MAPK/Nrf2信號(hào)通路，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，減少氧化應(yīng)激引起的SH-SYSY細(xì)胞死亡[18]。可見(jiàn)，天麻素通過(guò)其抗炎及抗氧化的作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。但是天麻素是否能夠降低氧化應(yīng)激反應(yīng)以及是否能夠降低tau蛋白磷酸化呢？為了探討這一問(wèn)題，本研究選用AD經(jīng)典模型tau轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)考察天麻素對(duì)tau蛋白磷酸化的影響;并對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻素能夠降低AD模型小鼠腦內(nèi)p-tau202的表達(dá);此外，天麻素治療組小鼠腦內(nèi)MDA含量明顯降低，SOD活性有所升高;治療后的小鼠腦內(nèi)CHAT的表達(dá)較AD模型小鼠降低。上述實(shí)驗(yàn)表明，天麻素可以通過(guò)減少氧化應(yīng)激降低AD模型小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平，從而對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。但是，天麻素是通過(guò)哪一信號(hào)通路發(fā)揮作用的是我們需要繼續(xù)研究的問(wèn)題。

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（收稿日期：2019-12-03）