印加孔雀草對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

鄆玲玲，張瑞海，宋振，付衛(wèi)東，王然，王忠輝，張國良

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081

外來入侵雜草對(duì)生物多樣性、生態(tài)環(huán)境以及人類生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重的影響（Montserrat et al.，2011；萬方浩等，2002；閆小玲等，2014）。在入侵植物與土著植物的種間競爭中，土壤微生物可能起到了重要的“橋梁”的作用，外來植物可能通過改變?nèi)肭值赝寥牢⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)與功能促進(jìn)自身生長或阻礙共生植物的生長和更新（Yu et al.，2005；Li et al.，2006）。大量研究表明，入侵植物可以通過改變土壤微生物功能類群來改變養(yǎng)分循環(huán)及其他環(huán)境條件，進(jìn)而形成有利其競爭的微生態(tài)環(huán)境，以利于快速形成自身群落，最終實(shí)現(xiàn)入侵（Katharine et al.，2006；彭鑫怡等，2019；Niu et al.，2007；宋振等，2016）。入侵植物紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）根系可從根際土壤中選擇性富集梭狀芽胞桿菌（Clostridium）和腸桿菌（Enterobacter），這些根際微生物的變化使土壤營養(yǎng)成分更有利于紫莖澤蘭生長（Chen et al.，2019）；菊科植物黃頂菊（Flaveria bidentis）入侵導(dǎo)致土壤中鏈霉菌（Streptomyces）、中華桿菌（Saprospiraceae）等細(xì)菌的豐度增加，而芽孢桿菌（Bacillus）、Solibacterales等細(xì)菌的豐度減少，這些微生態(tài)環(huán)境的改變可能會(huì)影響本地植物的生長發(fā)育，從而有利于黃頂菊的入侵、競爭與擴(kuò)張（Song et al.，2017）；飛機(jī)草（Chromolaena odorata）可以富集入侵地土壤中的土傳致病真菌半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum），使其能夠抑制當(dāng)?shù)刂参锏纳L，促進(jìn)自身的入侵過程（Vaisakh et al.，2012）。另外，植物之間的競爭作用也會(huì)改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（Garbeva et al.，2004），如閆素麗等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，黃頂菊與高丹草（Sorghum bicolor×S.sudanense）、向日葵（Helianthus annuus）、紫花苜蓿（Medicago sativa）和黑麥草（Lolium perenne）4種替代植物混合種植可以改變黃頂菊入侵地的微生物群落結(jié)構(gòu)，使其接近于替代植物的土壤微生物類群，這可能是替代植物對(duì)黃頂菊具有較強(qiáng)競爭優(yōu)勢的原因所在；李光義等（2013）研究發(fā)現(xiàn)不同搭配方式的白三葉（Trifolium repens）、雜交甜高粱（Sorghum dochna）、雜交狼尾草（Pennisetum alopecuroides）與入侵雜草勝紅薊（Ageratum conyzoides）混種對(duì)土壤細(xì)菌多樣性產(chǎn)生了不同程度的影響。

印加孔雀草（TagetesminutaL.）又名臭羅杰，屬菊科（Asteraceae），萬壽菊屬（Tagetes），一年生草本植物，原產(chǎn)自南美洲南部，后引種到歐洲、亞洲、非洲、馬達(dá)加斯加島、印度、澳大利亞以及夏威夷等地區(qū)。在我國境內(nèi)，2006年首次臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)印加孔雀草（Wang et al.，2006），2011年在北京郊區(qū)發(fā)現(xiàn)了印加孔雀草野生群落（張勁林等，2014），并呈現(xiàn)種群入侵?jǐn)U張趨勢，近幾年陸續(xù)在河北、山東、山西、西藏等多地發(fā)生大面積危害（張瑞海等，2019）。印加孔雀草對(duì)生境的適應(yīng)能力強(qiáng)，耐干旱、耐鹽堿、耐瘠?。℉ulina，2008）；具有強(qiáng)大的繁殖能力，種子小、產(chǎn)量高、且易傳播（張勁林等，2014）；并分泌化感物質(zhì)抑制其伴生植物的生長（Meissner et al.，2013）。目前國內(nèi)對(duì)其研究較少，研究內(nèi)容主要集中在形態(tài)學(xué)、發(fā)生危害等方面，張瑞海等（2019）分析證明了印加孔雀草為具有危害性和侵入性的物種，土艷麗等（2019）研究表明了惡性入侵植物印加孔雀草能顯著增加農(nóng)作物藏青稞的死亡率；而國外對(duì)印加孔雀草的研究主要集中在其精油的化學(xué)成分及利用等方面（Martín et al.，2005）。

目前國內(nèi)外對(duì)于印加孔雀草入侵對(duì)根際土壤微生物群落的影響研究尚未見報(bào)道。印加孔雀草入侵怎樣影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)？而與其共生植物存在競爭時(shí)又是否會(huì)造成土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化？基于以上問題，本研究采用第二代高通量測序技術(shù)，以印加孔雀草為研究對(duì)象，探討其入侵及與本地植物競爭條件下土壤微生物群落的響應(yīng)，比較分析印加孔雀草對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響及其與環(huán)境因子間的關(guān)系，以期從微生態(tài)學(xué)的角度探究印加孔雀草的入侵機(jī)制，為其綜合防控及生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料采集

試驗(yàn)所需印加孔雀草種子、入侵發(fā)生地原位土壤皆采集于北京市昌平區(qū)興壽鎮(zhèn)桃林村（40°13′47.98″N、116°25′26.63″E），該地位于北京市西北部，屬暖溫帶，為半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，具有明顯的干季和雨季，四季分明，是印加孔雀草入侵較為嚴(yán)重的地區(qū)之一。所采集的原位土壤為適合印加孔雀草生存但未入侵過的褐土，萬壽菊種子購買于市面種子公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置及取樣

試驗(yàn)區(qū)位于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所順義農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合試驗(yàn)基地（北京市順義區(qū) 40°14′55.42″N，116°39′23.10″），設(shè)置 4 個(gè)處理（花盆大小為：23 cm×18.4 cm）：未種植任何植物的裸土（不種植任何植物，記為CK）、本地植物萬壽菊單優(yōu)群落（只種植萬壽菊，記為 Te）、入侵植物印加孔雀草與本地植物萬壽菊混種群落（印加孔雀草與萬壽菊1：1種植，記為TmTe）、入侵植物印加孔雀草單優(yōu)群落（只種植印加孔雀草，記為Tm），每個(gè)處理3次重復(fù)。整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)50 d，覆蓋植物發(fā)芽、營養(yǎng)生長等過程，使其形成相對(duì)穩(wěn)定的根際微環(huán)境，期間保證適當(dāng)?shù)乃止?yīng)。試驗(yàn)結(jié)束后，將每個(gè)花盆輕輕去除上層土（3 cm左右），然后采用抖土法取得植物根際土壤（Hofman et al.，1989）。采集到的每個(gè)處理的土壤樣品充分混勻后，分別采用四分法取得一部分土壤樣品，裝進(jìn)自封袋，立即帶回實(shí)驗(yàn)室放入?80 ℃冰箱中，用于高通量測序；其他部分也分別裝進(jìn)自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于陰涼處自然晾干，用于測土壤 pH值、全氮（TN）、全磷（TP）、全鉀（TK）和有機(jī)質(zhì)（OM）等指標(biāo)。而后隨機(jī)選取各處理中（CK除外）長勢一致具有代表性的5株植株（混種處理中每種植物各選取5株），將植株洗凈，用于植物生物量的測定。

1.3 植物生物量及土壤理化性質(zhì)的測定

將植株洗凈，用濾紙吸去多余水分，120 ℃殺青、80 ℃烘干至恒質(zhì)量，測定植物干質(zhì)量。檢測前處理后的土壤樣品理化性質(zhì)，包括土壤pH值（電極法），有機(jī)質(zhì)（重鉻酸鉀容量法）、全氮（半微量開氏法）、全磷（碳酸氫鈉鉬藍(lán)法）以及全鉀（火焰光度法）含量，測定方法參照鮑士旦（2005）方法。

1.4 土壤DNA的提取及細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

采用土壤基因組 DNA提取試劑盒（北京，Solarbio公司）提取土壤樣品總基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外分光光度法檢測DNA純度。以純化后的DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)通用引物（V3F：5'-TACGGRAGGCA GCAG-3′，V4R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（Peiffer et al.，2013；Bortolini et al.，2016）。采用TransGen AP221-02 PCR反應(yīng)體系：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL，DNA 模板 10 ng，上、下游引物（5 μmol·L?1）各 0.4 μL，dNTP（2.5 mmol·L?1） 2 μL ， FastPfu Polymerase 0.4 μL ，5×FastPfu buffer 4μL，補(bǔ)充 ddH2O 至 20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用質(zhì)量體積比為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.5 Miseq文庫構(gòu)建及測序

樣品質(zhì)檢合格之后，構(gòu)建測序文庫，其步驟分為：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序（由北京奧維森基因科技有限公司提供），步驟如下：（1）DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；（2）另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋（bridge）”；（3）PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；（4）DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；（5）加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成 1個(gè)堿基；（6）用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；（7）將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端粘性，繼續(xù)聚合第2個(gè)核苷酸；（8）統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾。由于不同樣本間的 reads數(shù)不同，因此在分析多樣性和群落組成前，先依據(jù)最低 reads數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。區(qū)分樣品后進(jìn)行OTU（operational taxonomic unit）聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于 OTU進(jìn)行物種多樣性指數(shù)分析。基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。使用FLASH軟件（FLASH v 1.2.7）對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，得到OTUs數(shù)據(jù)（Raw Tags），利用Trimmomatic（v 0.33）對(duì)Raw Tags質(zhì)控過濾，得到Clean Tags，所得Clean Tags數(shù)據(jù)上傳至在美吉云平臺(tái) I-Sanger（https://www.i-sanger.com/），進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；?97%相似度下，利用 Usearch（vsesion 7.0）軟件在Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行OTU物種分類學(xué)分析和聚類分析。4組樣本利用Adonis置換多因素方差分析和 ANOSIM 相似性分析，判斷分組的可信度和可行性。

Ace、Chao指數(shù)為土壤細(xì)菌群落豐富度指標(biāo)，皆用以估計(jì)群落中OTU數(shù)目，Chao指數(shù)采用chao1算法（Chao，1984），Ace指數(shù)算法與其不同（Chao et al.，1993）；Shannon、Simpson 指數(shù)為用來估算樣品中細(xì)菌群落多樣性指標(biāo)，Shannon值越大群落多樣性越高（Shannon，1948a，1948b），Simpson指數(shù)則是由 Edward Hugh Simpson（1949）提出，Simpson值越大群落多樣性越低。利用 mothur（version v.1.30.1）對(duì) Ace、Chao、Shannon 和 Simpson指數(shù)進(jìn)行分析Alpha多樣性，用T檢驗(yàn)分析Alpha多樣性指數(shù)差異，然后用R作圖；利用柱形圖表示細(xì)菌群落組成；各樣本差異物種組成通過One-way ANOVA單因素方差分析，LEfSe軟件首先使用nonparametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test（非參數(shù)因子克魯斯卡爾—沃利斯秩和驗(yàn)檢）檢測具有顯著豐度差異特征，并找到與豐度有顯著性差異的類群，然后采用線性判別分析（LDA）來估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小；環(huán)境因子與菌群的關(guān)聯(lián)分析，檢測pH、OM、TN、TP、TK等5個(gè)指標(biāo)，利用單因素方差分析及posthoc檢驗(yàn)篩選不同樣點(diǎn)根際土壤菌群差異物種，通過計(jì)算環(huán)境因子與根際土壤菌群之間的相關(guān)性系數(shù)（Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)、Pearson相關(guān)系數(shù)等），然后利用Pheatmap Package軟件，將獲得的數(shù)值矩陣通過Heatmap圖展示出平均相對(duì)豐度前10的屬與環(huán)境因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 植物生物量及土壤理化性質(zhì)

各處理印加孔雀草與萬壽菊的生物量及土壤理化性質(zhì)指標(biāo)分析結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，無論單種（Tm、Te）處理還是混種（TmTe）處理，入侵植物印加孔雀草的生物量都顯著高于萬壽菊。土壤理化性質(zhì)結(jié)果顯示，相比于CK，3個(gè)處理（Tm、Te、TmTe）的土壤理化性質(zhì)都發(fā)生了不同程度的變化。土壤pH均呈堿性，且有印加孔雀草入侵過的土壤pH顯著增加，各處理之間差異顯著（P<0.05）；種植植物的3個(gè)處理中，TmTe的土壤全氮（TN）質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于Tm（P=0.033）與Te（P=0.722），均值為0.116%；Tm的土壤全鉀（TK）質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于 TmTe（P=0.047）與 Te（P=0.028），為 1.473%；土壤全磷（TP）、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在各處理之間差異不顯著。

表1 植物生物量及土壤理化性質(zhì)比較Table 1 Comparison of plant biomass, soil physical and chemical properties

2.2 土壤細(xì)菌的OTU豐度和α多樣性

對(duì) 12個(gè)樣品進(jìn)行高通量測序，共產(chǎn)生 223.72 Mb干凈數(shù)據(jù)，經(jīng)過拼接和過濾處理后，獲得 16S rDNA標(biāo)簽序列，并根據(jù)97%的序列相似性劃為不同的OTU。OTUs豐度稀釋曲線（圖1）顯示，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平坦但未達(dá)平臺(tái)期，說明大多數(shù)樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠，能夠反映樣品中的物種組成特征。

圖1 樣品在遺傳距離0.03下的稀釋曲線圖Fig. 1 The rarefaction of different samples obtained at the genetic distances of 0.03

圖2 樣品在遺傳距離0.03下的細(xì)菌α多樣性指數(shù)Fig. 2 Alpha diversity for different samples obtained at genetic distance of 0.03

土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)如圖 2所示，CK、Tm、Te與TmTe的Simpson指數(shù)均值分別為0.0035、0.0030、0.0035、0.0033，Shannon指數(shù)均值分別為6.75、6.89、6.82、6.80，Tm與CK表現(xiàn)出了明顯差異，Simpson指數(shù)顯著低于 CK（P=0.033）、Shannon指數(shù)顯著高于CK（P=0.024），說明印加孔雀草單優(yōu)群落的細(xì)菌群落多樣性最高，其它處理未表現(xiàn)出與CK的顯著性差異；CK、Tm、Te以及 TmTe的 Ace指數(shù)均值分別為 4035.9、3964.7、3918、3718.2，Chao指數(shù)的均值分別為4000.4、3928.6、3907.2、3691.7，TmTe的Ace指數(shù)顯著低于CK（P=0.039）與Tm（P=0.035）、Chao指數(shù)顯著低于CK（P=0.049），說明印加孔雀草與萬壽菊混種處理群落豐富度最低，印加孔雀草單優(yōu)群落的豐富度高于混種處理，萬壽菊單優(yōu)群落與其他處理未表現(xiàn)出顯著性差異。

2.3 高通量序列生物信息學(xué)分析

通過測序共產(chǎn)生4615個(gè)細(xì)菌OTU（圖3），其中 4個(gè)處理共有的 OTUs為 3169個(gè)，占總數(shù)的68.67%。CK的細(xì)菌群落數(shù)最高，平均含4189個(gè)細(xì)菌OTU；Tm次之，為4110個(gè)OTU；TmTe的細(xì)菌群落數(shù)最低，為3814個(gè)OTU。且TmTe和Te相比，TmTe特有的細(xì)菌OTU數(shù)目為321個(gè)，占8.42%。結(jié)果說明，不同處理帶來了不同程度的土壤細(xì)菌OTU差異，混種處理土壤細(xì)菌OTU數(shù)目最低，印加孔雀草單優(yōu)群落處理有使OTU數(shù)目升高的趨勢，這與α多樣性中的群落豐富度的研究結(jié)果一致。

圖3 細(xì)菌OTUs分布韋恩圖Fig. 3 Venn graph of bacteria OTUs distribution

2.4 細(xì)菌群落組成

選取各樣品中細(xì)菌在門分類水平上最大豐度排名前 10的物種，生成物種相對(duì)豐度堆積圖（圖4）。由圖4可知，4個(gè)處理的土壤樣品都具有豐富的物種，其中豐度最高的 5個(gè)門為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）及芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），共計(jì)占各處理的80%以上。12個(gè)樣品中所檢測到的細(xì)菌門的數(shù)量相似，但不同處理不同門所占的比例不同。相比于裸土（CK），其他3個(gè)處理中不同門所占比例都有不同程度的變化。進(jìn)一步分析3個(gè)處理（Te、TmTe、Tm）的群落組成平均值，發(fā)現(xiàn)隨著印加孔雀草密度的增加（Te、TmTe、Tm），放線菌門、綠彎菌門以及芽單胞菌門所占的比例呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，變形菌門呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而酸桿菌門呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，但差異不顯著。這表明不同門下的細(xì)菌在印加孔雀草入侵過程中發(fā)揮著不同的功能，而酸桿菌門有可能在其入侵過程中起到比較重要的作用。

圖4 門水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度柱形圖Fig. 4 The relative abundance of bacteria in Phylum level

2.5 Lefse多級(jí)物種差異判別分析

抽取出在門至屬水平上各處理序列數(shù)總和大于等于100個(gè)OTU的細(xì)菌，利用LEfSe軟件，可以得到Tm、Te、TmTe分別與CK相比顯著富集且具有顯著差異的菌，這些細(xì)菌與各自處理的植物群落的生長與維持關(guān)系密切，分別記為Tm vs CK、Te vs CK和 TmTe vs CK，對(duì)其進(jìn)行韋恩圖分析（圖5）。得到對(duì)印加孔雀草入侵有利的細(xì)菌，為共同存在于Tm vs CK和TmTe vs CK中但不屬于Te vs CK的10個(gè)OTU類群。對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析（表2）顯示，這10個(gè)OTU類群隸屬于變形菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）及酸桿菌門4個(gè)門，其數(shù)量分別為3、3、3、1個(gè)。其中，變形菌門下的有多囊粘細(xì)菌科（Polyangiaceae）、侏囊菌科（Nannocystaceae）等3個(gè)科下的3個(gè)菌屬；放線菌門下的有假諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、Ilumatobacteraceae科等2個(gè)科下的3個(gè)菌屬；藍(lán)細(xì)菌門下的有念珠藻科（Nostocaceae）、席藻科（Phormidiaceae）等2個(gè)科下的 3個(gè)菌屬以及酸桿菌門下Blastocatellaceae科下的 1個(gè)菌屬。另外，TmTe顯著性差異于其他處理的菌為圖中 29個(gè)OTU類群，Tm顯著性差異于其它處理的菌為圖中33個(gè)OTU類群。

圖5 3個(gè)處理分別顯著富集且具有顯著差異于CK的細(xì)菌韋恩圖Fig. 5 Venn graph of bacteria with significant enrichment and difference between the three treatments and CK

2.6 環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

選取各樣品中細(xì)菌在門分類水平上最大豐度排名前 10的物種，通過計(jì)算環(huán)境因子與菌群之間的 Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)，生成環(huán)境因子相關(guān)性Heatmap圖（圖6）。由圖6可知，不同菌群與各種環(huán)境因子體現(xiàn)出不同程度的相關(guān)性關(guān)系。其中，硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、酸桿菌門、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門以及芽單胞菌門與土壤全磷、全鉀含量呈不同程度的正相關(guān)，與土壤pH呈現(xiàn)出了不同程度的負(fù)相關(guān)，與土壤全氮和土壤有機(jī)質(zhì)含量無明顯相關(guān)性，個(gè)別呈現(xiàn)出了微弱的負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，放線菌門與土壤全鉀含量呈極顯著正相關(guān)（R=0.71735，P=0.00863），硝化螺旋菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門以及芽單胞菌門與土壤全鉀含量呈顯著正相關(guān)。但是，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）與環(huán)境因子之間的關(guān)系不同于其他菌門，具體表現(xiàn)與土壤全氮、全磷、全鉀含量呈微弱的負(fù)相關(guān)，與pH、有機(jī)質(zhì)含量呈微弱的正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

高通量序列生物信息學(xué)及α多樣性分析結(jié)果表明，印加孔雀草單優(yōu)群落的土壤細(xì)菌群落多樣性最高且顯著高于CK，其它處理未表現(xiàn)出與CK的顯著性差異，這說明印加孔雀草的入侵可以提高土壤細(xì)菌群落多樣性，且入侵植物印加孔雀草對(duì)于土壤細(xì)菌多樣性的作用效果要大于與其共生的萬壽菊。宋振等（2016）在研究同為菊科的入侵植物黃頂菊的根際微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃頂菊單優(yōu)群落的土壤細(xì)菌群落多樣性顯著高于本地植物，這與本研究的結(jié)果是一致的；入侵植物空心蓮子草（Altemanthera philoxeroides）可以通過改變土壤微生物菌群的結(jié)構(gòu)和豐富度從而影響土壤有機(jī)碳的形成，其入侵提高了土壤微生物群落的多樣性（李珂，2019），印加孔雀草提高土壤細(xì)菌群落多樣性從而形成有利于自身生長的微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而提高生物量以促進(jìn)自身生長及發(fā)育，這很有可能是其入侵成功的重要原因之一。有研究表明，紫莖澤蘭與本地植物存在競爭時(shí)，其土壤細(xì)菌的群落豐富度與未入侵土壤及紫莖澤蘭單優(yōu)群落土壤之間未表現(xiàn)出明顯差異（朱珣之等，2015）；互花米草（Spartina alterniflora）入侵改變了土壤微生物群落和提高了根際微生物豐富度，而高豐富度的根際微生物影響了土壤養(yǎng)分循環(huán)和植物間的競爭關(guān)系，從而促進(jìn)互花米草快速生長，并成功入侵（章振亞等，2012）。在本研究中，印加孔雀草與萬壽菊混種處理的群落豐富度最低且顯著低于 CK，印加孔雀草、萬壽菊單種處理都未表現(xiàn)出與CK的顯著性差異，說明印加孔雀草與萬壽菊種間競爭使得土壤細(xì)菌群落豐富度降低，這可能是萬壽菊與印加孔雀草相互作用的結(jié)果。

表2 在印加孔雀草入侵過程中起重要作用的10種菌在各水平上的分類及數(shù)目Table 2 Classification and the number in 10 bacteria that play an important role in invasion process of T. minuta L.

圖6 門分類水平上最大豐度排名前10的細(xì)菌與環(huán)境因子的相關(guān)性Heatmap圖Fig. 6 Heatmap map of the correlation between bacteria and environmental factors in the top 10 most abundant species on Phylu m level

本研究各處理中豐度最高的5個(gè)門依次為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門。通過 Lefse多級(jí)物種差異判別以及進(jìn)一步的Venn分析，得到共同存在于Tm vs CK和TmTe vs CK中但不屬于Te vs CK的類群，為4個(gè)門（變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門等）下的8個(gè)科（多囊粘細(xì)菌科、侏囊菌科、念珠藻科等）的共10個(gè)OTU類群，這些類群可能在印加孔雀草在入侵過程中起著重要作用。例如，多囊粘細(xì)菌科與侏囊菌科屬于粘細(xì)菌，隸屬于變形菌綱的粘球菌目。粘細(xì)菌是一類捕食菌，也是繼放線菌和真菌之后又一重要的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌（王春玲等，2019），廣泛分布于全球各地的土壤中，能夠形成對(duì)溫度、干旱、輻射、鹽脅迫均具有抗性的粘孢子，而具有較高的環(huán)境適應(yīng)力（Shimkets，1991），其群落和代謝產(chǎn)物對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境的改變很可能有利于印加孔雀草的入侵。而與TmTe顯著差異的存在于Tm、Te的29個(gè)OTU類群可能有利于維持印加孔雀草入侵的土壤微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，Tm顯著性差異于 Te、TmTe的33個(gè)OTU類群則可能有利于印加孔雀草單優(yōu)群落狀態(tài)的維持，但是否是這些 OTU類群及其功能還需要進(jìn)一步深入研究。

不同門類的細(xì)菌同時(shí)受到土壤理化性質(zhì)和植被特性等環(huán)境因子的影響而產(chǎn)生差異（Zhou et al.，2017），本研究中環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，菌群與環(huán)境因子存在不同程度的顯著相關(guān)性，印加孔雀草入侵后，其根際土壤可能會(huì)快速形成穩(wěn)定的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性，有利于提高印加孔雀草其自身對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力以及單優(yōu)群落的形成。環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析也表明，不同門下的菌群與各種環(huán)境因子體現(xiàn)出不同的相關(guān)性特征，放線菌門與土壤全鉀含量呈極顯著正相關(guān)，硝化螺旋菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門以及芽單胞菌門與土壤全鉀含量呈顯著正相關(guān)，而藍(lán)細(xì)菌門與環(huán)境因子的關(guān)系則表現(xiàn)出了和其他菌門較為不同的特點(diǎn)。藍(lán)細(xì)菌是發(fā)現(xiàn)的最早能夠利用光合作用釋放氧氣的原核生物（Bryant，1995），在自然界中不僅分布在淡水、海水等水體中，也廣泛分布在各類土壤以及極端環(huán)境中（Nicholas et al.，1992）。本研究中藍(lán)細(xì)菌表現(xiàn)出與環(huán)境因子特殊的相關(guān)性可能是由于印加孔雀草在快速繁殖擴(kuò)散過程中對(duì)土壤有機(jī)物合成和氧氣釋放有著較為特殊的需求。

植物根系分泌的很多次生代謝物質(zhì)可作為植物與土壤微生物互作的信號(hào)分子物質(zhì)而影響植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)（Ueda et al.，2010；Ahuja et al.，2012），如豚草的次生代謝產(chǎn)物對(duì)土壤微生物具有一定的選擇抑制作用（趙昕，2003），黃頂菊次生代謝產(chǎn)物紫云英苷可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)（張瑞海，2017）等。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，印加孔雀草植株能夠分泌萜烯類化感物質(zhì)從而抑制伴生植物的生長（Liza et al.，2008；Scrivanti et al.，2003），是否這些物質(zhì)也導(dǎo)致了印加孔雀草土壤微生物的改變從而有利于自身群落的穩(wěn)定，或者有其他特殊的次生代謝產(chǎn)物影響了土壤微生物群落，需要進(jìn)一步深入研究。另外，本研究采用了入侵地未生長過印加孔雀草的單一褐土類型土壤，然而不同土壤類型的起始土壤細(xì)菌群落的組成存在差異，這種差異很可能會(huì)影響入侵種對(duì)土壤的響應(yīng)，印加孔雀草對(duì)不同土壤類型的響應(yīng)是否與本試驗(yàn)結(jié)果存在不同，這還需要大量重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行研究。

3.2 結(jié)論

印加孔雀草入侵能夠改變?nèi)肭值赝寥兰?xì)菌多樣性。印加孔雀草顯著提高了土壤細(xì)菌群落多樣性，其與萬壽菊混種使得土壤細(xì)菌群落豐富度顯著降低，且印加孔雀草競爭效果大于非入侵植物萬壽菊；土壤中細(xì)菌相對(duì)豐度最高的前5個(gè)門分別是變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門；不同菌群與環(huán)境因子表現(xiàn)出了不同程度的正負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中放線菌門、硝化螺旋菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門以及芽單胞菌門與土壤全鉀含量呈顯著正相關(guān)，藍(lán)細(xì)菌門和環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系不同于其他菌門；多囊粘細(xì)菌科、侏囊菌科、念珠藻科等8個(gè)科的10個(gè)OTU類群有可能在印加孔雀草入侵過程中起著重要作用。本研究結(jié)果為揭示印加孔雀草入侵的土壤微生態(tài)機(jī)制提供了理論依據(jù)。