沙拐棗甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆與生物信息學分析

房永雨，郝麗芬，聶利珍，丁海君，王力偉，趙小慶，孫 杰，史志丹，何江峰

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)植物蛋白質(zhì)組學重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

沙拐棗（Calligonum mongolicum） 為蓼科（Polygonaceae）沙拐棗屬（Calligonum）的一種灌木，主要分布于我國內(nèi)蒙古中西部、甘肅西部以及新疆東部的干旱荒漠地區(qū)[1]。沙拐棗多生于沙地、沙礫質(zhì)荒漠和礫質(zhì)荒漠，是優(yōu)良的防風固沙植物，具有生長快、易繁殖、耐沙埋、耐旱、抗風蝕的特點，多年生植株受到嚴重風蝕后，仍能正常開花結實[2]。沙拐棗的根系發(fā)達，經(jīng)沙埋仍能迅速生成不定根，主根向下生長，側根擴大；根系具有較厚的木栓組織，能有效保護輸導組織；同時其綠色的同化枝具有發(fā)達的木質(zhì)部，提高了在荒漠中的生存韌性。沙拐棗植物體內(nèi)束縛水與自由水的比值較高，使植物具有較高的吸水和持水能力，原生質(zhì)體處在高濃度環(huán)境中時，可提高植物細胞的黏滯性，增強植株的抗熱和抗脫水能力[3]。因此，沙拐棗在保持組織水分、增強組織吸水和貯水能力方面有很大的優(yōu)勢，可以適應干旱、高溫、風沙等多重脅迫。

甘氨酸甜菜堿（glycine betain，以下簡稱甜菜堿）是植物的重要滲透調(diào)節(jié)劑，在植物遇到鹽堿、干旱、高溫等逆境脅迫時，幫助植物細胞維持滲透平衡，并可保護蛋白酶活性，激活抗逆基因表達，提高植物的抗逆能力[4]。甜菜堿作為重要的植物抗逆物質(zhì)，其合成途徑是在膽堿單加氧酶的催化下以膽堿為底物生成甜菜堿醛，通過甜菜堿醛脫氫酶（BADH）的氧化生成甜菜堿[5]。甜菜堿醛脫氫酶是合成甜菜堿的關鍵蛋白酶。目前，已從互花米草[6]、剛毛檉柳[7]、胡楊[8]、堿蓬[9]、耐鹽柳樹[10]、鹽節(jié)木[11]、海馬齒[12]中克隆得到BADH 基因，將BADH 基因轉入水稻[13]、馬鈴薯[14]、玉米[15]、棉花[16]、大豆[17]和番茄[18]等農(nóng)作物，這些農(nóng)作物的抗逆性得到不同程度的提高。但是并未見到有關沙拐棗完整BADH 基因的研究，鑒于沙拐棗對于干旱、高溫、風沙的適應性，本試驗從沙拐棗中克隆CmBADH 基因，并對其進行生物信息學分析，旨在為進一步利用沙拐棗CmBADH 基因的抗逆功能和解析其分子作用機制提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

沙拐棗種子采集于內(nèi)蒙古阿拉善沙地，播種于直徑為20 cm 的花盆中，基質(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石（5∶1），種植于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照/黑暗為16 h/8 h。培養(yǎng)30 d，干旱脅迫8 d，剪取嫩葉，液氮速凍，保存于-80 ℃，用于RNA 的提取。

1.2 試驗試劑

總RNA 提取采用天根植物總RNA 提取試劑盒；反轉錄采用EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；RACE 克隆采用SMARTer RACE 5′/3′ Ki（t大連TaKaRa 生物醫(yī)藥科技有限公司）；基因全長高保真克隆采用TransStartFastPfu DNA PolymerasePCR 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒、平末端克隆載體和大腸桿菌感受態(tài)采用EasyPurePCR Purification Kit、pEASY-Blunt Cloning Kit 和Trans1 -T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 沙拐棗總RNA 的提取 液氮研磨的沙拐棗枝葉，按照天根植物總RNA 提取試劑盒說明書提取沙拐棗總RNA。使用Nanodrop 2000 檢測其純度和濃度，利用瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測其完整性。

1.3.2 沙拐棗cDNA 的合成 采用EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix試劑盒獲得cDNA。反轉錄體系為20 μL，包含總RNA（200 ng/μL）2 μL，Anchored Oligo（dT）Primer（0.5 μg/μL） 1 μL，2 ×ES Reaction Mix 10 μL，EasyScriptRT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water 5 μL。反應程序為：42 ℃溫育25 min，85 ℃滅活5 s，4 ℃保持。反應產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.3.3 沙拐棗CmBADH 基因克隆與測序 根據(jù)前期沙拐棗轉錄組測序結果，得到BADH 基因的中間片段，以此為基礎設計RACE 引物（表1）。5′和3′RACE -Ready cDNA 的 制 備 按 照 TaKaRa 的SMARTer RACE 5′/3′ Kit 說明進行。以5′ 和3′RACE-Ready cDNA 為模板，分別克隆5′和3′端序列，反應體系為50 μL：包含5′ 或3′RACE-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′或3′GSP 1 μL，2×SeqAmpTMBuffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 15.5 μL；反應程序：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s，58 ℃，10 s，72 ℃，1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保持。將擴增產(chǎn)物回收，連接到Blunt vector，轉化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1，涂布在含Kan 的LB 平板培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。第2 天進行藍白斑篩選，挑選陽性單斑進行菌斑PCR，驗證正確后送北京華大六合基因測序。

表1 沙拐棗CmBADH 基因克隆引物

將5′和3′端序列進行拼接，設計CmBADH 基因全長引物（表1），反應體系50 μL：5× FastPfu Bufer 10.0 μL，BS 2 μL，BA 2 μL，cDNA 1 μL，dNTP（2.5 mM）1 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 1μL，ddH2O 33 μL 反應程序：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s，59 ℃，10 s，72 ℃，1 min，30 個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保持。然后連接載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)進行測序，具體操作同上。

1.3.4 沙拐棗CmBADH 基因和蛋白的生物信息學分析 為了掌握沙拐棗CmBADH 基因和蛋白的序列信息，利用生物信息學分析軟件對沙拐棗CmBADH 基因序列進行拼接，對蛋白序列進行如下分析：包括基本理化性質(zhì)分析、磷酸化位點預測、跨膜結構域、亞細胞定位預測、信號肽位點預測、結構域分析、二級結構預測、三級結構建模、系統(tǒng)進化樹構建（表2）。

表2 沙拐棗CmBADH 基因和蛋白生物信息學分析明細

2 結果與分析

2.1 沙拐棗CmBADH 基因的克隆

首先提取沙拐棗的總RNA，電泳結果顯示總RNA 的28S、18S、5.8S 條帶清晰完整（圖1），可以進行反轉錄及后續(xù)試驗研究。進一步通過RACE 技術克隆獲得CmBADH 基因的5′和3′端片段（圖2）。將電泳片段膠回收，轉化大腸桿菌，進行測序，利用SeqMan 軟件對測序序列進行拼接，得到CmBADH基因cDNA 的全長為1 863 bp，在NCBI 網(wǎng)站進行Blastn 比對，發(fā)現(xiàn)CmBADH 與海馬齒（Sesuvium portulacastrum）、山谷櫟（Quercus lobata）、鹽爪爪（Kalidium foliatum） 的BADH 相似性分別達到80.04%、79.97%、79.55%，可以確認拼接得到了CmBADH 基因序列。

2.2 沙拐棗CmBADH 基因和蛋白的序列分析

利用TBtools 軟件預測沙拐棗CmBADH 基因的開放閱讀框（ORF）為1 506 bp，編碼501 個氨基酸，將CDS 區(qū)與序列最相似的海馬齒、栓皮櫟、鹽爪爪的BADH 基因的CDS 比對（圖3），相似性達到87.55%。沙拐棗CmBADH 蛋白質(zhì)中含有與醛脫氫酶高度保守的十肽VTLELGGKSP 結構，以及含有與酶功能有關的11 個半胱氨酸殘基（圖3）。

2.3 沙拐棗CmBADH 蛋白的理化性質(zhì)及結構分析

利用Prot Param tool 在線軟件預測，沙拐棗CmBADH 基因的相對分子量為123.46 kDa，等電點（pI）為5.01，不穩(wěn)定指數(shù)［instability index（Ⅱ）］為44.24，屬于穩(wěn)定類型的蛋白。脂肪指數(shù)（aliphatic index）為26.49，GRAVY 為0.677，為弱疏水性蛋白。

利用Netphos3.1 分析磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在7 個絲氨酸（serine）磷酸化位點、4 個蘇氨酸（threonine）磷酸化位點、5 個酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點。

運用在線軟件TMHMM Server 2.0 分析，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)不含有跨膜結構域。運用PSORT Prediction分析發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)蛋白定位到微體（microbody）的可能性為0.829，利用信號肽預測工具SignalP 5.0 分析發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)蛋白不含有信號肽。

對沙拐棗CmBADH 蛋白結構域進行分析，發(fā)現(xiàn)含有一個甜菜堿醛脫氫酶結構域（PLN02467），其中含有NAD（P）結合位點，具有氧化還原酶活性（圖4）。

利用SOPMA 分析編碼區(qū)二級結構（圖5），發(fā)現(xiàn)沙拐棗CmBADH基因的CDS 區(qū)α 螺旋含有217 aa，占43.31%；無規(guī)則卷曲含有160 aa，占31.94%；延伸鏈含有87 aa，占17.37%；β 轉角含有37 aa，占7.38%。利用SWISS-MODEL 構建基因的CDS 區(qū)三級結構模型，其結構模型為橢球形（圖6）。

2.4 沙拐棗CmBADH 蛋白序列的系統(tǒng)進化分析

從NCBI 下載CmBADH 蛋白的同源序列，利用MEGA7 軟件的CLUSTER W 作同源序列比對，使用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，多序列比對和系統(tǒng)進化樹結果顯示（圖7），沙拐棗的CmBADH 同剛毛檉柳（Tamarix hispida AIL24123.1）、火龍果（Hylocereus undatus），莧屬的千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）和三色莧（Amaranthus tricolor）的同源性較高。沙拐棗CmBADH 蛋白同油橄欖（Olea europaea XP022850208.1）、煙草（Nicotiana tabacum JQ654640.1）的同源性較低。

3 討論與結論

BADH 基因是參與植物抗逆的關鍵基因，本研究結合二代測序結果，通過RACE 克隆技術，首次從沙拐棗中克隆出BADH 基因的cDNA 序列，并預測開放閱讀框（ORF）為1 506 bp，編碼501 個氨基酸。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫搜索和文獻報道，目前已克隆得到的其他植物物種的BADH 基因的CDS 序列長度在1 494 ～1 521 bp[19]，本研究沙拐棗BADH 基因CDS 區(qū)的序列大小在此范圍內(nèi)。通過與相似物種的核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)（圖3），CDS 序列5′端序列保守，而在3′端序列不保守，一是表現(xiàn)為長度不同，二是表現(xiàn)為終止密碼子不同。

通過生物信息學分析預測沙拐棗CmBADH 蛋白共有16 個磷酸化位點；不含有跨膜結構域；不含有信號肽位點；在二級結構中α 螺旋和無規(guī)則卷曲是散布于該多肽鏈中的大量結構元件，以上結論與菠菜、山菠菜、遼寧堿蓬、玉米等BADH 基因的結果相同[19]。沙拐棗CmBADH 蛋白預測定位到微體中，且為弱疏水性蛋白，這與馬鈴薯、鹽爪爪、菠菜、山菠菜、互花米草、遼寧堿蓬、玉米等物種的結果不同[19]，以上物種的BADH 蛋白為親水性蛋白，定位到葉綠體和過氧化物酶體中[20]，推測BADH 蛋白的親疏水性與亞細胞定位有關，但需深入研究。沙拐棗CmBADH 具有橢球形三級結構的蛋白，這與互花米草BADH 的結果相似[6]。系統(tǒng)進化樹結果顯示，沙拐棗CmBADH 與木本植物剛毛檉柳的同源性最高。沙拐棗CmBADH 蛋白中含有甜菜堿醛脫氫酶結構域（圖4），且含有醛脫氫酶高度保守的十肽VTLELGGKSP 以及多個與酶功能有關的半胱氨酸殘基（圖3），符合醛脫氫酶的典型特征，與相關研究報道的結果相同[21-22]。

BADH 是甜菜堿合成過程中的兩個關鍵酶之一，在植物抗逆過程中起重要作用，目前，已利用基因工程手段，將BADH 基因轉入農(nóng)作物，使農(nóng)作物的抗性得到不同程度的提高。本試驗為進行CmBADH 組織特異性表達、亞細胞定位、表達調(diào)控研究以及利用CmBADH 基因提高植物抗逆性，后期培育抗逆作物品種奠定基礎。