CD11b+細(xì)胞誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1研究

許軍英，廖原，馮葉葉，王小芳，陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的復(fù)雜疾病，導(dǎo)致人類死亡的重要原因。適應(yīng)性免疫細(xì)胞以及固有免疫細(xì)胞在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用，如CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[1]。CD8+T細(xì)胞是發(fā)揮抗腫瘤的主要免疫細(xì)胞，腫瘤微環(huán)境中存在大量抗腫瘤抗原特異性的CD8+T細(xì)胞[2]。CD8+T細(xì)胞可特異性識別腫瘤抗原，CD8+T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞機(jī)制如下：通過分泌分泌穿孔素、顆粒酶B引起腫瘤細(xì)胞凋亡；通過表達(dá)死亡受體Fas與腫瘤細(xì)胞表面的配體FasL結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；通過分泌TNF-α等改變靶細(xì)胞溶酶體的穩(wěn)定性，抑制靶細(xì)胞的代謝以及活化靶細(xì)胞核酸內(nèi)切酶引起細(xì)胞死亡等。但是，腫瘤細(xì)胞仍然難以被全部清除，因為在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞極容易耗竭[3]。

腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)是低糖、低氧、偏酸性的微環(huán)境，其中包含大量免疫抑制成分，包括發(fā)揮多種發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophage,TAM)、骨髓來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Regulatory cell,Tregs)及抑炎因子IL-10、TGF-β等[4]。在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運能力下降以及糖酵解受到抑制，抑制CD8+T細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能[5]。腫瘤抗原長期刺激以及慢性病毒感染導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞耗竭，早期耗竭以IL-2分泌減少、殺傷靶細(xì)胞能力下降和克隆性增殖能力受損為主，此時，CD8+T細(xì)胞仍可產(chǎn)生TNF-α；進(jìn)展到T細(xì)胞耗竭晚期，IFN-γ產(chǎn)生能力明顯受損，其基因表達(dá)譜有別于效應(yīng)T細(xì)胞以及記憶T細(xì)胞亞群[6]。

耗竭CD8+T細(xì)胞表面廣泛表達(dá)程序死亡性受體1(Programmed cell death protein 1,PD-1)[7]，PD-1是CD8+T細(xì)胞免疫抑制性受體之一。程序性死亡配體1(Programmed Cell Death 1 ligand 1,PD-L1)表達(dá)于多種細(xì)胞表面。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，傳導(dǎo)抑制信號，抑制CD8+T細(xì)胞活化代謝以及增殖，引起CD8+T細(xì)胞凋亡[8-9]。除此之外，耗竭CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)其他免疫抑制分子，如淋巴活化基因-3(Lymphocyte activation gene 3,LAG-3)以及T細(xì)胞免疫球蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3,TIM-3)[10]。腫瘤微環(huán)境中還存在大量以腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated Macrophages,TAMs)為主CD11b+的細(xì)胞以及部分MDSC和DC，其中MDSC以及TAMs發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤生長[11]。但是，CD11b+細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1是否相關(guān)尚不清楚。本研究著重探討在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與實驗動物

小鼠肺癌細(xì)胞株3LL；C57BL/6小鼠，雌鼠，體重20～25 g，購買自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.2 主要試劑和儀器

流式抗體(PE-CY7 anti-mouse CD45、APC anti-mouse PD-1、FITC CD8 anti-mouse、APC anti-mouse CD19、Pacific BuleTManti-mouse CD3、anti-mouse TIM-3、anti-mouse LAG-3)，Biolegend公司；CD11b+細(xì)胞磁珠分選試劑盒以及CD8+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒，美天旎公司；PBS、1640、胎牛血清，Gibco公司；流式儀BD AriaⅢ，BD公司。

1.3 構(gòu)建小鼠皮下荷瘤模型

在37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中使用75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3LL細(xì)胞，待其長勢良好，制備成單細(xì)胞懸液，使用PBS重懸。選取10只健康C57小鼠，隨機(jī)平均分為兩組，一組為正常對照組，一組為腫瘤模型組。將模型組小鼠經(jīng)腹腔麻醉，于左下腹皮下注射3LL單細(xì)胞懸液，細(xì)胞注射量為106/只。于第7天，發(fā)現(xiàn)小鼠左下腹皮下腫瘤明顯生長。于第14天，將小鼠脫臼處死。剝?nèi)⊥暾[瘤組織，稱重。

1.4 腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液

將腫瘤組織剪碎，使用膠原酶處理，PBS洗滌兩次后，裂解紅細(xì)胞過濾，使用PBS重懸。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，取200 μL濃度為1×106/mL的細(xì)胞，使用Fc受體封閉，加入表面熒光抗體，4攝氏度避光孵育30 min后，PBS洗脫2次，洗脫未結(jié)合抗體，使用PBS重懸后，使用流式儀進(jìn)行檢測細(xì)胞膜表面分子標(biāo)志。

1.6 MACS分選細(xì)胞

使用免疫磁珠MACS分選CD8+T細(xì)胞以及CD11b+細(xì)胞，于超凈臺中取荷瘤小鼠脾臟，研磨，過濾，裂解紅細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，使用MACS分選試劑分別分選CD8+T細(xì)胞以及CD11b+細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測分選細(xì)胞的純度，純度較好，可供使用。

1.7 CD8+T細(xì)胞、CD11b+細(xì)胞共培養(yǎng)

將分選所的CD8+T細(xì)胞、CD11b+細(xì)胞1∶1共培養(yǎng)，使用3LL細(xì)胞培養(yǎng)上清(10%)，在37 ℃和5% CO2中培養(yǎng)48 h。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤實質(zhì)的重量與腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)

構(gòu)建小鼠皮下荷瘤模型，于第十四天，將小鼠處死，剝?nèi)⊥暾哪[瘤組織(圖1A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤微環(huán)境中各免疫細(xì)胞(圖1B)，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中存在大量的CD11b+細(xì)胞，在免疫細(xì)胞中占53.8%左右。此外，T細(xì)胞以及其他類型免疫細(xì)胞細(xì)胞在免疫細(xì)胞中所占比例分別為16.4%，29.8%(圖1C)。分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中CD3+T細(xì)胞比例越高，腫瘤體積越小，即腫瘤的重量與腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)(圖1D)。

圖1 腫瘤的重量與腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)

2.2 腫瘤微環(huán)境中CD8+PD-1+T細(xì)胞比例增高

取小鼠腫瘤組織，制備成單細(xì)胞懸液，檢測CD8+T細(xì)胞在免疫細(xì)胞中所占的比例，CD45是所有免疫細(xì)胞共有的標(biāo)志。經(jīng)流式檢測分析，CD8+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞中所占比例為10%左右(圖2A)。

與正常小鼠比較，脾臟以及外周血中CD8+PD-1+T細(xì)胞比例沒有變化(P>0.05)；荷瘤小鼠淋巴結(jié)中，CD8+PD-1+T細(xì)胞比例升高(P<0.05)；腫瘤微環(huán)境中CD8+PD-1+T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)，占CD8+T細(xì)胞數(shù)量的40%左右(圖2B、2C)。同時，腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞表達(dá)其他免疫抑制性受體如TIM-3、LAG-3(圖2D)。

t檢驗，*表示正常組小鼠與荷瘤組小鼠淋巴結(jié)中CD8+PD-1+T細(xì)胞相比，P<0.05； ##表示荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中CD8+PD-1+T細(xì)胞比例與荷瘤小鼠脾臟中CD8+PD-1+T細(xì)胞比例相比，P<0.01。圖2 腫瘤微環(huán)境中CD8+PD-1+T細(xì)胞比例增高

2.3 CD11b+細(xì)胞誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表PD-1

腫瘤微環(huán)境中除腫瘤細(xì)胞之外，存在大量CD11b+細(xì)胞，我們推測CD11b+細(xì)胞可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1。取荷瘤組小鼠脾臟，制備成單細(xì)胞懸液，利用磁珠分選分別分選CD8+T細(xì)胞以及CD11b+T細(xì)胞。

對照組的CD8+T細(xì)胞使用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清處理48 h，實驗組將CD8+T細(xì)胞與CD11b+共培養(yǎng)，并使用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清處理48 h。經(jīng)流式檢測分析，CD11b+細(xì)胞誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1(圖3A)，與對照組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)。

*表示CD8+T細(xì)胞純培養(yǎng)與CD8和CD11b+細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，P<0.05。圖3 CD11b+細(xì)胞誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表PD-1

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤大小與腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)，說明T細(xì)胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。T細(xì)胞主要分為兩大類細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞。其中CD4+Th1細(xì)胞通過分泌IFN-γ、TNF-α，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，抑制CD4+Th2細(xì)胞增殖[12]，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。Treg以及CD4+Th2細(xì)胞通過分泌抑炎因子在抗腫瘤免疫中發(fā)揮免疫抑制作用[10]，促進(jìn)腫瘤逃逸。

CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫應(yīng)答中主要細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞中大約占10%，CD8+T細(xì)胞可通過分泌IFN-γ、TNF-α、穿孔素以及顆粒酶等殺傷腫瘤；也可通過表達(dá)FasL，與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。PD-1即程序性死亡受體，作為T細(xì)胞表面免疫抑制性受體，抑制CD8+T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤殺傷效應(yīng)，造成腫瘤細(xì)胞逃逸。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，抑制CD8+T細(xì)胞活化代謝以及增殖，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞殺傷功能受到抑制[13]。CD8+T細(xì)胞與CD11b+細(xì)胞共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，CD11b+細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1。

CD11b+細(xì)胞是髓系來源的免疫細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞占較大的比例。此外，腫瘤微環(huán)境中存在少量樹突狀細(xì)胞以及MDSC等。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抗原提呈能力降低，分泌Th2細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤血管形成[14]。MDSC通過表達(dá)精氨酸酶-1，導(dǎo)致微環(huán)境中L-精氨酸缺乏，CD8+T細(xì)胞增殖受限；分泌抑炎細(xì)胞因子TGF-β、IL-10，表達(dá)PD-L1等發(fā)揮免疫抑制作用[15]。PD-L1除了廣泛表達(dá)于髓系來源的免疫細(xì)胞表面，還表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，進(jìn)而抑制CD8+T細(xì)胞的功能。目前，PD-1/PD-L1單抗可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能，在惡性腫瘤的臨床治療方面取得良好的效果。有研究表明，腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)量較高的患者，使用PD-L1單抗治療效果教好[16]。因而，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能，抑制腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用的免疫細(xì)胞的功能[17]，對于腫瘤治療非常重要。其次，揭示腫瘤微環(huán)境中各免疫細(xì)胞的特性及其相互作用的機(jī)制，對于改善腫瘤微環(huán)境進(jìn)而提高機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)具有重要的科學(xué)意義。

綜上所述，腫瘤微環(huán)境CD11b+細(xì)胞可通過誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)免疫抑制受體PD-1，抑制CD8+T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答。在腫瘤微環(huán)境中，CD11b+細(xì)胞可能是通過分泌細(xì)胞因子或是通過細(xì)胞膜表面分子的相互作用誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1。因而，可將CD11b+細(xì)胞作為腫瘤治療的靶點，從而為腫瘤免疫治療提供新思路。