生物炭基Rs-198菌劑對辣椒的耐鹽促生性能研究

魏萌萌，劉嘯塵，何艷慧，武占省,*

(1 石河子大學化學化工學院，新疆 石河子 832003；2 西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，陜西 西安 710048)

近年來，新疆土壤鹽堿化日益加重，嚴重影響了新疆地區(qū)農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量。利用根際促生細菌(PGPR，Plant growth-promoting rhizobacteria)開發(fā)有效促進作物生長、提高作物抗鹽性的微生物制劑，已成為目前綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究熱點，具有廣闊的應用前景。PGPR是植物根際的菌群，具有維持健康的根部環(huán)境、營養(yǎng)吸收和緩解環(huán)境脅迫的能力，從而促進植物的生長和產(chǎn)量增長[1]。PGPR通過一系列直接和間接的機制促進植物生長發(fā)育，主要包括：固氮、溶磷、產(chǎn)生嗜鐵素、植物生長調節(jié)劑、有機酸，以及酶如ACC脫氨酶、幾丁質酶和葡聚糖酶等影響植物代謝，因此，被認為是一種緩解植物鹽脅迫的有效方法[2]。惡臭假單胞菌Rs-198(Rs-198，PseudomonasputidaRs-198)是課題組前期從棉花根際篩選的菌株，經(jīng)鑒定該菌株具有促生和緩解鹽脅迫的功能。何艷慧等[1]以Rs-198為原料制備的微膠囊制劑，在鹽脅迫條件下對棉花的生長有促進作用,發(fā)芽率和生物量均有顯著提高，并可通過降低脯氨酸和丙二醛的積累來緩解鹽脅迫。然而，根際土壤是一個復雜的微環(huán)境系統(tǒng)，游離的菌株易受土壤pH值、水分含量變化等的影響，因此，合適的載體對于提高Rs-198菌株的效率非常必要。

生物炭是生物質熱解過程中的一種富含碳的副產(chǎn)物，因在固碳、減少溫室氣體排放、土壤改良、環(huán)境修復等方面的多種功能而受到越來越多的關注[3]。生物炭具有多孔結構、含碳量高、比表面積大的特性，施用到土壤中可以降低養(yǎng)分損失，提高肥料養(yǎng)分利用率[4]。Farhangi-Abriz等[5]的盆栽實驗在3種鹽水平下(0、6、12 dS/m的NaCl)使用3種不同比例的生物炭處理菜豆土壤(每盆重量比0、10%、20%生物炭)，結果發(fā)現(xiàn)，施用生物炭可提高菜豆地上部和根干重，并且有鹽組中經(jīng)過生物炭處理的土壤上幼苗中超氧化物酶(SOD，Superoxide dismutase)活性、多酚氧化酶(PPO，Polyphenol oxidase)活性和過氧化物酶(POD，Peroxidase)活性都有下降。生物炭具有較大的內部孔隙結構，可以為微生物提供暫時保護，減少線蟲和原生動物的捕食并延長生存期[6]。Saifullah等[7]也報道了在鹽脅迫下，生物炭和叢枝根菌聯(lián)合使用比單獨添加更有效地增加植物產(chǎn)量，主要是因為二者聯(lián)用增加了植物的P和Mn的承受能力，并且改善了Na/K值。

本研究利用經(jīng)濟成本低廉的生物竹炭(BB，Bamboo biochar)作為載體，負載Rs-198菌株制備成生物炭基Rs-198菌劑(BBRs，Biochar inoculatedPseudomonasputidaRs-198)，通過研究菌劑對辣椒在鹽脅迫下的生物量、生長指標、色素含量、滲透物質及抗氧化酶活性的影響，探究生物炭基Rs-198菌劑緩解鹽脅迫的功效和機理，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 Rs-198的發(fā)酵培養(yǎng)

將Rs-198(Rs)菌株接種到NA培養(yǎng)基中(牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L)，并在30 ℃下，以170 r/min的速率發(fā)酵24 h至穩(wěn)定期以獲得菌液。通過逐級稀釋涂平板計數(shù)法測定發(fā)酵液中活菌數(shù)為1.86×109CFU/mL。

1.2 生物炭基Rs-198制劑的制備

竹炭(BB)購自烏魯木齊新佳美圖環(huán)?？萍加邢薰尽７鬯楹筮^100目篩。生物炭的理化性質：pH 9.91，EC 848.33 uS/cm，BET比表面積1.3 m2/g，平均孔徑21.78 nm。高溫滅菌后，5 g生物炭與2 mL的Rs-198菌液在無菌環(huán)境中混合，負載24 h。生物炭基Rs-198菌劑(BBRs)制備完成并保存在密封的聚乙烯塑料袋中。

1.3 辣椒種植和鹽脅迫處理

辣椒品種是新疆昌吉市新科種子有限公司提供的紅龍23號。將種子用95%乙醇滅菌5 min，用純凈水沖洗3次，然后用干抹布擦拭。盆栽土從石河子大學試驗站取得，該土壤被歸類為灰漠土，理化性質：pH8.08，EC688 uS/cm，速效氮128.33 mg/kg，速效磷69.16 mg/kg，速效鉀363.73 mg/kg。盆栽實驗在實驗室光照培養(yǎng)箱中進行。

盆栽處理分為2組，無鹽(0%NaCl)處理和鹽(0.5%NaCl)處理，具體處理設置見表1。每盆土300 g，每盆10粒種子。每個處理種10盆。發(fā)芽后，保持水分，播種后10 d向鹽處理的每個盆中添加100 mL0.5%NaCl溶液，期間定期補充蒸餾水，30 d后測量辣椒幼苗的生理指標。

表1 辣椒盆栽實驗處理

1.4 辣椒幼苗指標測定

1.4.1 辣椒生物量和生長指標測定

30 d后，將盆中全部辣椒苗從土壤中輕輕拔出，沖洗干凈，稱量整株植物的質量，記為鮮重(FW)。用米尺測量幼苗株高和根長，用游標卡尺測幼苗莖的直徑。記錄葉面積。將葉片放入具塞比色管中4～6 h，取出擦拭水分，稱重得飽和鮮重(SW)。然后將幼苗烘干至恒重，此時稱重記為干重(DW)，計算相對水含量(RWC)[5,8-9]。

1.4.2 辣椒葉片葉綠素含量測定

辣椒葉片在提取劑(丙酮和乙醇體積比為2∶1)中放置過夜。葉子全部變白后，計算葉綠素a、b[10]。

1.4.3 辣椒葉片生化指標的測定

考馬斯亮藍G-250比色法測定葉片中的可溶性蛋白[5,8]?？扇苄蕴呛坑杀椒臃y定[11]。脯氨酸的含量通過磺基水楊酸法測定[5,8,12-13]。電解質滲透率(EL)測定參考[9]和[14]。

1.4.4 抗氧化酶的提取和活性測定

SOD活性采用四唑氮藍光還原法測定[5,9,13,15]。PPO活性在398 nm處測量OD值[5]。POD活性測定是以每分鐘內A470變化0.01作為1個POD的單位(U)表示[5,9,15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結果為平均值±標準偏差。顯著性水平為P<0.05下使用單因素方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，然后進行S-N-K檢驗。數(shù)據(jù)分析和繪圖軟件通過Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 不同處理下辣椒的生物量

在0.5%NaCl組中，辣椒幼苗的株高、根長、鮮重、干重較0%NaCl組均受到抑制(圖1)。

a—株高；b—根長；c—鮮重；d—干重。圖1 不同處理下辣椒幼苗的生物量

在不加鹽組中，與CK1相比，Rs1的株高、根長、鮮重、干重分別增加了6.81%、2.71%、33.33%、50.00%；BB1的株高、根長、鮮重、干重分別增加了30.41%、44.42%、39.22%、50.00%；BBRs1的株高、根長、鮮重、干重分別增加了37.47%、46.50%、56.86%、100.00%，且BBRs1的增加幅度大于Rs1、BB1，表明在土壤中添加菌劑，生物竹炭和Rs-198菌劑會增加植物的生物量，且二者聯(lián)用具有協(xié)同作用。在0.5%NaCl組中，與CK2相比，Rs2的株高、根長，鮮重分別增加了4.65%，7.69%，7.41%；BB2的株高、根長、鮮重、干重分別增加了23.11%、9.40%、16.67%、25.00%；BBRs2的株高、根長、鮮重、干重分別增加了26.43%、24.27%、42.59%、50.00%。表明在土壤中添加菌劑，生物炭和Rs-198菌劑會提高辣椒耐鹽脅迫的能力，且二者在鹽脅迫下仍具有協(xié)同作用。因此，生物炭負載PGPR是一種促進作物生長的有效方法。

2.2 不同處理下辣椒的生長參數(shù)

辣椒的生長參數(shù)是辣椒幼苗生長情況的重要指標。圖2顯示了0%NaCl和0.5%NaCl脅迫下，不同處理對辣椒幼苗的莖粗、葉面積、葉片數(shù)和RWC的影響。不加鹽組的結果可以看出，與CK1相比，BBRs1的莖粗、葉面積、葉片數(shù)和RWC分別增加了22.41%、31.55%、11.63%、5.14%，且BBRs1比BB1和Rs1增加的幅度大。在0.5%NaCl組中，與CK2相比，BBRs2莖粗、葉面積、葉片數(shù)和RWC增加23.41%、14.03%、12.79%、3.54%。表明在土壤中添加炭基菌劑會改善辣椒的生長參數(shù)。

a—莖粗；b—葉面積；c—葉片數(shù)；d—RWC。圖2 不同處理條件下辣椒的生長參數(shù)

2.3 不同處理下辣椒的色素含量

從圖3可以看出鹽脅迫會降低葉片中葉綠素的含量。0%NaCl條件下，與CK1相比，BBRs1處理后，葉綠素a、b增加了28.33%、26.67%。與BB1和Rs1相比，BBRs1并沒有顯著的效果。0.5%NaCl條件下，BBRs2處理后，葉綠素a、b增加了47.22%、62.50%，而BB2和Rs2并沒有顯著增加辣椒葉片的葉綠素a、b的含量。因此，不論在非鹽脅迫還是鹽脅迫條件，添加BBRs均有利于緩解鹽脅迫、促進葉綠素的合成，并體現(xiàn)出協(xié)同增效的效果。

a—葉綠素a含量；b—葉綠素b含量。圖3 不同處理下辣椒的葉綠素含量

2.4 不同處理下辣椒的生化指標

所有處理的可溶性蛋白含量加鹽組較不加鹽組都有大幅度增加，以更好地應對鹽脅迫造成的影響。由圖4a知，在0%NaCl條件下，土壤中施加BB1、Rs1對辣椒葉片的可溶性蛋白含量影響不大。在0.5%NaCl條件下，Rs2、BB2、BBRs2分別比CK2降低了15.65%、16.49%、33.07%。由圖4b知，在0%NaCl條件下，Rs1、BB1、BBRs1的可溶性糖降低，但不顯著。在0.5%NaCl條件下，BB2、Rs2的添加降低了可溶性糖的含量，BBRs2可溶性糖的含量降低了57.78%。這些結果表明，BBRs2處理能顯著提高葉片的生物活性和植物的健康性，減少自由基的積累和對植物細胞的損傷。如圖4c所示，在0.5%NaCl鹽脅迫下，其脯氨酸含量顯著高于不加鹽組，說明鹽脅迫使得植物需要積累大量的脯氨酸以抵抗鹽脅迫。在無鹽條件下，各處理的脯氨酸沒有顯著性變化。在0.5%NaCl的鹽脅迫條件下，Rs2、BB2和BBRs2分別降低了植物脯氨酸18.29%、45.12%、62.20%的含量，較好地保持了細胞滲透平衡。從圖4 d可以看出，在0.5%NaCl脅迫下，辣椒葉片的EL增加，說明鹽脅迫會對植物產(chǎn)生不利影響。但是在使用BBRs2后，EL降低了36.88%，Rs2和BB2也有所降低，表明BB2、Rs2、BBRs2均可以降低辣椒植物的電解質滲透率，提高植物體內金屬離子與外界的交換能力，避免鹽離子的積累。

a—可溶性蛋白；b—可溶性糖；c—脯氨酸含量；d—電解滲透率。圖4 不同處理條件下辣椒的生化指標

2.5 不同處理下辣椒的抗氧化酶活性

BBRs通過降低SOD、PPO和POD的活性來消除應激的負面影響。圖5a結果表明，在0%NaCl條件下，Rs1對SOD降低并不顯著，而BB1、BBRs1分別降低了32.68%、39.46%。在0.5%NaCl條件下，Rs2降低SOD效果不顯著，但BB2、BBRs2顯著性降低了25.87%、35.68%。圖5b結果表明，在非鹽脅迫和鹽脅迫條件下，各處理對PPO降低效果均不顯著。圖5c結果表明，在0%NaCl條件下，Rs1對POD降低并不顯著，而BB1、BBRs1分別降低了28.81%、42.33%。在0.5%NaCl條件下，Rs2降低POD效果不顯著，但BB2、BBRs2的POD活性顯著性降低了32.09%、37.20%。

a—SOD活性；b—PPO活性；c—POD活性。圖5 不同處理下辣椒的抗氧化酶活性測定

3 討論

本研究中，施加BBRs可以協(xié)同生物炭和Rs-198的功能增加辣椒的株高、根長、干重和鮮重(圖1)；莖粗、葉面積、葉片數(shù)和RWC(圖2)，并且BBRs緩解鹽脅迫效果顯著，說明生物炭負載耐鹽菌劑可以發(fā)揮二者的優(yōu)勢，緩解鹽脅迫，協(xié)同促進植物生長。Hammer等[16]用針葉樹木屑球為材料制備的生物炭和叢枝菌根真菌(AMF)二者單獨施用具有緩解鹽脅迫，提高萵苣的植株和根的干重的效果，二者聯(lián)用效果更顯著。Farhangi-Abriz等[17]研究表明生物炭在鹽脅迫下可以提高豆科植物的葉面積和RWC。生物炭通過直接和間接的機制促進植物生長，向植物提供礦物質養(yǎng)分(Ca、Mg、P、K、S)是直接的，而改善土壤的物理、化學和生物特性從而促進植物生長是間接的機制。生物炭影響土壤pH、養(yǎng)分有效性、養(yǎng)分循環(huán)、離子交換能力和緩沖能力。何艷慧等[1]研究過Rs-198具有緩解鹽脅迫促進棉花生長的功能，而Rs-198則會通過固氮、溶磷、分泌IAA等植物激素促進植物的生長。BBRs1、BBRs2處理后，葉綠素a分別增加了28.3%、47.22%，葉綠素b分別增加了26.67%、62.5%。與無鹽組比，在鹽脅迫下辣椒的葉綠素含量降低(圖3)，是因為鹽通過阻止植物對鎂和鐵等基本元素的吸收來抑制葉綠素的合成[10]。

土壤過量的鹽分會導致植物產(chǎn)生活性氧(ROS，Reactive oxygen species)的積累，進而影響植物細胞生長和產(chǎn)物的積累。植物具有有效的活性氧清除系統(tǒng)，保護其免受破壞性氧化反應的傷害。抗氧化酶是活性氧清除系統(tǒng)中最重要的酶類，也是植物抗鹽機制的重要因素。植物體內過量的ROS可以被SOD、POD、PPO等酶清除。SOD能將氧自由基(O2·-)代謝為過氧化氫(H2O2)，從而保護細胞不受損害。POD主要位于細胞外基質和液泡，在催化H2O2生成H2O和O2·-方面起重要作用。植物在鹽脅迫下通常會積累酚類化合物，PPO活性的升高會提升植物細胞內氧化和降解有毒的酚類化合物的能力[5]。植物細胞滲透調節(jié)和積累有機溶質的能力是耐鹽機制的另一個主要因素。植物組織中游離脯氨酸、可溶性糖和蛋白質等關鍵滲透物質的積累可以作為滲透調節(jié)對脅迫耐受程度的表征。可溶性糖主要由較大碳水化合物分子的分解而獲得，在鹽脅迫下水平升高的原因是維持細胞滲透壓平衡、避免細胞失水，同時保護了細胞膜和其他細胞結構免受鹽脅迫的負面影響[12]。在鹽脅迫條件下植物可溶性蛋白含量和可溶性糖增加，能夠提高植物細胞的滲透調節(jié)能力，降低植物的損傷程度[10]。脯氨酸是微生物、動物和植物對抗活性氧抑制作用的主要非酶抗氧化劑之一[5,8]，在調節(jié)植物細胞的滲透勢、保護亞細胞結構和大分子免受滲透脅迫等方面具有重要作用。此外，它通常被認為是一種有效的活性氧清除劑，與防止凋亡有關[18]。鹽脅迫程度越高，植物體內積累的脯氨酸含量越高，以保持細胞滲透壓，防止細胞脫水。

不加鹽組中，可溶性蛋白、可溶糖、脯氨酸和電解質滲透在處理后較空白對照CK1降低了。0.5%NaCl條件下比無鹽條件的可溶性蛋白、可溶糖、脯氨酸和電解質滲透都升高了，但是在加Rs-198，BB和BBRs后，可溶性蛋白、可溶糖、脯氨酸和電解質滲透率都降低了(圖4)。說明滲透脅迫對辣椒植株細胞有很大的緩解作用。這一結果與Lashari[18]的兩年田間試驗，在鹽脅迫土壤中施加的生物炭堆肥降低了可溶糖、脯氨酸和電解質滲透率的含量的結果是一致的。孟長軍[19]的研究也表明，相對電導率越大，膜透性越大，質膜受損傷的程度越高。電解質滲透率反映細胞膜透性的大小，而膜透性又直接反映植物細胞對細胞內環(huán)境的穩(wěn)定能力和對外界環(huán)境的適應和抵御能力，是抗?jié)B透脅迫的主要生理指標之一。因此生物炭負載菌劑的改良不僅可以有效地降低植物鹽脅迫，而且對植物的生化過程也同樣重要[18]。

結果表明，無鹽條件下，生物炭基菌劑會降低SOD、POD和PPO含量，生物炭基菌劑處理的SOD、POD和PPO在鹽脅迫下也分別降低(圖5)。Farhangi-Abriz等[5]也報道了無鹽條件下10%的生物炭降低了SOD和PPO，雖然鹽度增加了大豆幼苗SOD、PPO和POD酶的活性，但是施加生物炭后降低了。BBRs通過降低SOD、POD和PPO的活性來消除應激的負面影響，認為BBRs在應激條件下具有防御作用[12]。

4 結論

生物炭基菌劑BBRs在非鹽和鹽脅迫下均促進辣椒生長并緩解鹽脅迫。在0.5%NaCl鹽脅迫下，生物炭基菌劑處理顯著提高了辣椒的生物量、生長參數(shù)和色素含量，降低了辣椒的生化指標和抗氧化酶的活性。表明BBRs通過降低滲透物質和抗氧化酶的積累緩解了鹽脅迫，可以有效清除鹽脅迫引起的氧自由基，促進辣椒生長，為解決鹽脅迫問題提供了思路和方法，有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。