“海蜜”系列甜瓜蔓枯病抗性來源分子標(biāo)記初步評價

孫亞亭 陳 靜 孫博文 包衛(wèi)紅 錢春桃*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇省南京市 210095；2海門市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇省南通市 226100 ）

“海蜜”系列甜瓜因抗逆性強、口感好，在江蘇省及其周邊地區(qū)得到了廣泛栽植；但在其生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，“海蜜”系列甜瓜有感染蔓枯病的現(xiàn)象，尤其在設(shè)施連作條件下，蔓枯病發(fā)生風(fēng)險較大。蔓枯病是一種在葫蘆科瓜類植物上常見的病害，甜瓜生產(chǎn)上患病植株可高達 25%以上，嚴重時可造成瓜類減產(chǎn)80%[1-2]。目前，化學(xué)防治是甜瓜生產(chǎn)上防治蔓枯病常用的方法，但易造成環(huán)境污染。因此，篩選抗病資源、培育抗病品種是防御甜瓜蔓枯病發(fā)生既生態(tài)又經(jīng)濟的措施。但是，甜瓜蔓枯病病原菌存在致病性分化，甜瓜品種僅攜帶單個抗病基因，在生產(chǎn)過程中抗性會減弱甚至完全喪失[3-5]，而不同抗性基因的聚合有助于提高作物的抗性和抗譜[6-8]，且國際上先后報道了多種甜瓜蔓枯病抗源，包括PI140471、PI1 57082、PI511890、PI482398、PI482399和PI420145等，抗性基因分別為Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、gsb-5和Gsb-6[9-10]，這為“海蜜”系列甜瓜利用不同抗性基因聚合改良對蔓枯病的抗性提供了可能。

開展抗性聚合改良，首先需進行人工接種鑒定和遺傳群體構(gòu)建，以考察抗性分離情況，確定抗性基因是非等位基因，這是一個周期較長的過程。而分子標(biāo)記輔助選擇可以提高育種效率。前人研究顯示，大多數(shù)甜瓜品種的抗性來源于PI140471（Gsb-1）[8]，實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，抗源PI482398（Gsb-4）的抗性高于Gsb-1[11]。因此，筆者擬采用Gsb-1和Gsb-4已有的分子標(biāo)記對“海蜜”系列甜瓜的蔓枯病抗性來源進行分子標(biāo)記快速鑒定，從而為“海蜜”系列甜瓜利用不同蔓枯病抗性基因進行聚合改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 甜瓜材料和接種菌株

6份“海蜜”系列甜瓜材料（“海蜜2號”“海蜜4號”“海蜜5號”“海蜜6號”“海蜜8號”“海蜜10號”）由江蘇省南通市海門市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，甜瓜單基因抗源材料PI140471（Gsb-1）（CK1）、PI 482398（Gsb-4）（CK2）由美國康乃爾大學(xué)Molly John 教授提供，感病品種“白皮脆”（CK3）由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

蔓枯病病菌為本實驗室分離純化并保存的A1型菌株，菌株的分生孢子在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)25 ℃暗培養(yǎng)7 d后，再進行4 d間歇紫外燈（每天12 h紫外/12 h黑暗）處理產(chǎn)生[12]，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板將分生孢子懸浮液配成5×105個/mL備用。

1.2 田間接種鑒定

試驗于2019年秋季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地進行。所有甜瓜材料采用50孔穴盤播種育苗，每個品種種植30株，重復(fù)3次。7月25日播種，8月10日待幼苗長至3葉1心后定植于塑料拱棚，采用地膜覆蓋栽培，田間管理正常。11月2日采用噴霧法[3]接種病菌，用噴霧器向功能葉反復(fù)噴灑制備好的菌液，直至葉面滴水，2周后觀察植株發(fā)病情況。

甜瓜蔓枯病病情分級標(biāo)準：0級，無病斑；1級，老葉上邊緣壞死或斑點＜10 mm，新葉無病斑；2級，新葉上邊緣壞死或斑點＜10 mm，老葉邊緣壞死；3級，多數(shù)葉片有感染，葉壞死面積＜25%；4級，25%＜葉壞死面積≤50%；5級，葉壞死面積＞50%。

平均病級計算公式： RI=∑(級值×株數(shù)) ÷總株數(shù)。

根據(jù)平均病級（RI）確定蔓枯病抗性級別：高抗(HR)，RI＜1.0；抗(R)，1.0≤RI＜2.0；中抗(MR)，2.0≤RI＜3.0；感(S)，3.0≤RI＜4.0；高感(HS)，RI≥4.0。

1.3 DNA提取及分子標(biāo)記檢測

DNA提取參照 CTAB 法。用于檢測抗病基因Gsb-1和Gsb-4的分子標(biāo)記為本課題組設(shè)計[11，13]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見表1。

PCR總反應(yīng)體積為20μL： ddH2O 12.1μL，10×PCR Buffer 2.0μL，2 mmol/L dNTP 1.5 μL，25 mmol/L MgCl21.2μL，10μmol/L引物各1.0μL，5U/μLTaq聚合酶 0.2μL，30 ng/μL模板DNA 1.0μL。

擴增反應(yīng)條件：94 ℃反應(yīng)5 min；94 ℃反應(yīng)30 s，55 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)80 s，35個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)5 min；保持4 ℃。

表1 抗病基因與對應(yīng)分子標(biāo)記

PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用 Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對蔓枯病的田間抗性表現(xiàn)

自然發(fā)病鑒定有時發(fā)病較輕，不能代表品種或材料的真實抗病程度。由表2可知，兩種抗源材料PI140471和PI482398對蔓枯病均表現(xiàn)為高抗；感病對照“白皮脆”發(fā)病較重，表現(xiàn)為感病；“海蜜6號”對蔓枯病表現(xiàn)為抗病，其余品種對蔓枯病均表現(xiàn)為中抗。

表2 蔓枯病田間抗性評價

2.2 抗蔓枯病基因分子標(biāo)記的鑒定

通過對“海蜜”系列甜瓜進行抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-4分子標(biāo)記的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)6份“海蜜”系列甜瓜均未得到與Gsb-1分子標(biāo)記相同的190 bp條帶；“海蜜2號”“海蜜6號”擴增出了與Gsb-4分子標(biāo)記相同的120 bp條帶和180 bp條帶，而“海蜜4號”“海蜜5號”只擴增出Gsb-4標(biāo)記的180 bp條帶，“海蜜8號”“海蜜10號”只擴增出120 bp條帶。見表3。

表3 抗蔓枯病基因分子標(biāo)記檢測

3 結(jié)論及討論

田間抗性鑒定結(jié)果表明，“海蜜6號”對蔓枯病的抗性表現(xiàn)達到抗病等級，“海蜜2號”“海蜜4號”“海蜜5號”“海蜜8號”“海蜜10號”均只達到中抗等級。其中，“海蜜2號”對蔓枯病的抗性水平與以前報道的結(jié)果一致[14]，表明本研究采取的田間接種鑒定是可靠的。至于“海蜜6號”比其它“海蜜”系列甜瓜對蔓枯病抗性強的原因，則需對它們的抗性基因結(jié)構(gòu)和表達調(diào)控的異同進行比較研究。

結(jié)合抗病基因分子標(biāo)記P C R檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)“海蜜2號”“海蜜6號”可以擴增出Gsb-4分子標(biāo)記的兩條帶，但不能擴增出Gsb-1的目標(biāo)片段。因此，本研究初步判斷“海蜜2號”“海蜜6號”的染色體中具有與Gsb-4相同的抗性位點，但不具有與Gsb-1相同的抗性位點。結(jié)合前期研究結(jié)果，聚合抗源對不同濃度的蔓枯病病菌均表現(xiàn)為抗，而單一抗源對不同濃度蔓枯病病菌表現(xiàn)出選擇性抗性且抗性水平低于聚合抗源。因此，對于“海蜜2號”“海蜜6號”（含有Gsb-4），可用PI140471(Gsb-1)來提高其抗性；其余“海蜜”系列甜瓜只擴增出一條Gsb-4的片段，還不能判斷其抗性來源與Gsb-4是否相同，需進一步鑒定，但它們均未擴增出Gsb-1的目標(biāo)產(chǎn)物，也可采用PI140471（Gsb-1）進行抗性改良。