DNA條碼技術在上海辰山植物園10種燈誘夜蛾科昆蟲種類鑒定中的應用

陳東旭 （上海市綠化管理指導站，上海市黃浦區(qū) 200020；上海城市樹木生態(tài)應用工程技術研究中心，上海市黃浦區(qū) 200020)

防治有害生物是園林植物養(yǎng)護過程中的一個重要環(huán)節(jié)，防治效果的好壞直接影響園林景觀和植物長勢。有效地預測預報園林植物病蟲害發(fā)生情況，可以較好地為養(yǎng)護人員提供預警信息，以便園林養(yǎng)護人員及時對病蟲害進行人為干預，降低病蟲害對景觀的影響，從而達到病蟲害綠色防控的目的。在病蟲預測預報工作中常使用自動蟲情測報燈（自動蟲情測報燈可以自動啟動關閉，轉換接蟲器，自動排出雨水，且每天誘捕到的標本被裝入一個幼蟲袋，測報員一周進行一次收蟲工作即可，可大大減少工作量）進行蟲害監(jiān)測，其原理主要是利用黑光燈誘集鱗翅目、鞘翅目等有趨光性的成蟲[1-2]。但在害蟲測報與綜合治理工作中，測報員主要通過捕捉到昆蟲的翅膀紋路和病蟲圖譜進行初步比對，缺少了對雄性外生殖器及外部形態(tài)學特征進行分類這一專業(yè)環(huán)節(jié)，鑒定結果的準確度難以保證[3-4]；同時，自動蟲情測報燈收集到的很多鱗翅目、鞘翅目昆蟲的形態(tài)學特征相似，標本局部損壞易導致成蟲區(qū)分特征不明顯，這也為昆蟲種類鑒定帶來了很大難度。而利用DNA條碼技術作為昆蟲種類鑒定的輔助手段，可提高昆蟲種類鑒定結果的準確度[5-7]。

DNA條碼技術的原理是提取樣本基因組DNA，擴增其線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因序列片段并在數據庫內進行比對分析，進而對物種進行快速、準確的鑒定和分類[8]。目前，基于COI的DNA條形碼輔助物種分類技術已大量應用于害蟲的測報工作，對鱗翅目昆蟲分類鑒定的案例也已有很多報道[9-10]。但是，鑒于鱗翅目是昆蟲綱中第2個大目，已知種類超過20萬種，夜蛾科又是鱗翅目中最大的一科，具有2萬多個種類，且其中有很多種類是為害農作物的種類，也是林業(yè)生產中非常重要的害蟲[7]。故筆者擬對DNA條碼技術在鱗翅目夜蛾科昆蟲種類鑒定中的應用效果進行檢驗，以期建立快速準確的夜蛾科昆蟲鑒定方法，從而為夜蛾科昆蟲生態(tài)多樣性評估及綜合治理提供重要途徑。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及形態(tài)鑒定

本研究選取的樣本為夜蛾科昆蟲標本。供試昆蟲于2016年5月至2017年9月采自上海辰山植物園（植物園內生物多樣性豐富，能為動植物群落種類、生態(tài)評估、水體等方面的研究提供樣本）的三座自動蟲情測報燈，分別位于園內北、南、東三個方向。設備均為佳多牌自動蟲情測報燈，型號為JDB1-Ⅲ型，黑光燈管主波長為365 nm，誘蟲半徑為120 m。樣本收集后分類整理，選取肢體較為完整的43個樣本進行展翅，并保存于上海市綠化管理指導站實驗室，待形態(tài)學鑒定。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增和測序

基因組DNA提?。貉心?3個樣本的昆蟲腿部肌肉組織，提取基因組DNA，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增：合成鱗翅目COI基因通用引物，PCR擴增所用引物為LCO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)。EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑均購置于TakaRa公司。

PCR反應體系(50μL) ： 10倍PCR緩沖液5 μL，正向引物（20μmol/L）2.5μL，反向引物(20μmol/L)2.5μL，dNTP(10 mmol/L)1.5μL，Ex-Taq 1μL，模板DNA 2μL，加無菌水至50μL。

EX-TaqPCR擴增條件：94 ℃變性300 s；94℃、40 s，54 ℃、40 s，72 ℃、60 s，反應50個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 樣本信息及COI基因序列的GenBank登陸序列號

擴增產物純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 序列比對分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構建及樣本種類確定

采用Gene-Explorer軟件對43條基因序列進行修飾，利用BLAST檢索其相似性，所得序列均是線粒體COI基因片段。使用DNA Barcoding鑒定方法，用CLUSTAL軟件進行多序列比對[11-12]，導出FASTA格式文件。采用MEGA10軟件分析序列的保守位點（conserved sites，C）數、變異位點（variable sites，V）數、簡約信息位點（parsimin-formative sites，Pi）數、種間遺傳距離、種內遺傳距離、堿基偏倚性等信息。采用鄰接法，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-joining tree，NJ樹)[13-14]，并將測序基因片段在GenBank數據庫內進行檢索比對及鑒定種類。查閱文獻，根據樣本雄性外生殖器及外部特征，確定DNA條碼鑒定結果的準確度。

2 結果與分析

2.1 COI基因序列特征分析

以43個樣本的基因組DNA為模板，使用鱗翅目COI基因片段通用引物進行擴增，克隆得到了43條687 bp左右的基因片段，經過BLAST比對分析，序列均為線粒體COI基因序列。相關信息見表1。

根據雄性外生殖器及外部形態(tài)特征，43個夜蛾科昆蟲樣本的鑒定結果為10個種。其中，2個種類無中文名對應，且未查到這2個種的形態(tài)描述，未做形態(tài)鑒定。利用MEGA10軟件進行堿基含量分析，使用CLUSTAL軟件進行序列比對，43個樣本COI基因序列中均未發(fā)生缺失和插入情況，保守位點數、變異位點數、簡約信息位點數、單突變位點數分別為520個、163個、146個、16個。各堿基平均含量分別為：A（30.0%）、T（40.6%）、C（14.7%）、G（14.7%），其中G+C的含量（29.4%）明顯低于A+T的含量（70.6%），這與昆蟲線粒體堿基含量特征一致[15]。

由表2可知，10種夜蛾科昆蟲COI基因的堿基顛換率（Transversional Pairs）和轉換率（Transitionsal Pairs）分別為33%和19%，偏倚率R值（si/sv）為0.6。堿基的轉換以TC（84.2%）為主，少數為AG（15.8%）間的轉換；顛換多發(fā)生于TA堿基間（90.6%），CA堿基間顛換占總數的9.4%。鑒于物種間的親緣關系越近堿基轉換率越高，物種間親緣關系越遠則堿基替換率越高[8]，故不同夜蛾科昆蟲間親緣關系可以通過COI基因片段多序列分析結果推斷出。

表2 10種夜蛾科昆蟲COI基因片段堿基替換

2.2 種內及種間遺傳距離

基于p-distance模型，計算出43個樣本種內及種間的遺傳距離，并利用bootstrap（1 000次）進行檢驗[8]。由表3可知，種間遺傳距離在0.069 8～0.116 3之間，平均值為0.092 9。其中，粉紋夜蛾和白條夜蛾的遺傳距離是0.069 8，大耳紋夜蛾和中赫夜蛾的遺傳距離是0.070 8；乏夜蛾和粉紋夜蛾之間遺傳距離值最大（0.116 3）。43個樣本種內遺傳距離在0～0.001 5之間，平均值為0.000 5。種間遺傳距離遠大于種內遺傳距離，且種內遺傳距離最大值和種間遺傳距離最小值并未重疊，符合DNA條形碼檢驗的標準（種間差異是種內差異10倍）[16]。

表3 夜蛾科10種不同害蟲的種間和種內遺傳距離

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建分析

以43個樣本的COI基因序列作為靶標，采用MEGA10軟件進行數據分析，使用ClustalW功能進行序列比對，依據Kinura-2-Paramter 模型，采用鄰接法(Neighbour-Joining)構建系統(tǒng)進化樹，并進行重復1 000次的自舉檢驗。由圖1可知，不同種類樣本形成了獨立的進化分支。同時，聚類結果也反映了物種間的親緣關系，如淡劍紋灰翅夜蛾、梨劍紋夜蛾是近緣種，這兩個物種進化分支聚集在一起。因此，夜蛾科昆蟲COI基因序列具有足夠的遺傳變異性和分化度，既可區(qū)分種間種類，同時種內相對保守。

3 結論與討論

園林植物是城市園林綠化專類園和綠地的重要組成部分，蟲害的發(fā)生會對園林植物的健康生長造成巨大威脅，所以蟲害綠色防控是園林植保工作的重要環(huán)節(jié)，且只有在蟲害發(fā)生后及時判別害蟲的種類和發(fā)生規(guī)律，才能采取有效措施控制其為害；同時，對一個城市來說，一個區(qū)域的蟲害發(fā)生情況，對該城市的整體綠化養(yǎng)管也具有一定的警示作用。因此，需要對害蟲的消長動向進行預測預報，以便及時發(fā)出預警，從而更有效地對蟲害進行綠色防控。但是，園林害蟲種類繁多、形態(tài)各異，幾乎所有的園林植物會受害，且在蟲害大發(fā)生前較難被發(fā)現。而自動蟲情測報燈的應用，可以準確地對害蟲未來發(fā)生危害的時間和嚴重程度等情況進行預測預報，從而減少監(jiān)測員的勞動強度。

自動蟲情測報燈雖然能監(jiān)測目標植物群落內活動昆蟲種類的消長規(guī)律，且誘集到的昆蟲種類多樣，但誘集的鱗翅目昆蟲成蟲肢體和翅膀易破碎或粘成一團，較難準確區(qū)分和鑒定昆生種類[17]，再加上植保技術人員和監(jiān)測員在昆蟲分類學專業(yè)性知識上相對欠缺，導致很難使用傳統(tǒng)分類特征來區(qū)分昆生種類。同時，鱗翅目昆蟲屬于完全變態(tài)昆蟲，其在不同發(fā)育階段的形態(tài)特征差異較大，而鑒定往往要根據成蟲特征來進行判斷，但鱗翅目昆蟲種類與數量龐大，且很多近似種成蟲差異細微，這也給非專業(yè)鑒定人員帶來了極大困難。因此，需在傳統(tǒng)根據成蟲進行鑒別分類的基礎上，利用DNA條碼技術對近似種、隱形種和新種進行鑒定，以縮短排查時間，提高工作效率，提升鑒定結果的精確性，這對于蟲害綜合治理意義重大[18]。

本研究結果表明，應用DNA條碼技術輔助傳統(tǒng)分類方法進行夜蛾科種類鑒定，具有較高的準確度；對43個樣本基因序列進行比對分析，種間遺傳距離遠大于種內遺傳距離，且種內遺傳距離最大值和種間遺傳距離最小值并未重疊，符合DNA條形碼檢驗的標準；采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹的結果顯示，不同種昆蟲也會各自聚集到一個單系群。

DNA條碼技術可輔助應用于自動蟲情測報燈誘捕到的夜蛾科昆蟲的分類鑒定與測報，其雖暫時不能取代傳統(tǒng)分類工作，但將其作為輔助手段用于形態(tài)鑒定，可有效提高種類鑒定的效率和準確度。隨著GenBANK等數據庫的發(fā)展，DNA條碼技術在夜蛾科昆蟲種類鑒定工作中將得到更多的應用。