青島即墨丁字灣潮間帶菌種資源及優(yōu)勢度

王淑嫻，宋愛環(huán)，劉 童，辛美麗，葉海斌，吳海一

(山東省海洋生物研究院 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104)

潮間帶是低潮線與最大高潮線之間的海陸交互地帶，雖然區(qū)域非常狹窄但卻具有很高的生產(chǎn)力。這里有規(guī)律性的潮汐漲落，多樣化的生境類型，顯著的人類活動，微環(huán)境的變化非常大，因此潮間帶的生物必須具有超強的適應(yīng)環(huán)境的能力。潮間帶具有豐富而獨特的微生物資源，是微生物聚集的基地，是調(diào)查微生物資源、優(yōu)勢度及多樣性的重要場所。青島即墨丁字灣位于即墨、萊陽和海陽三市的交界處，周圍被山丘環(huán)抱，屬海洋性氣候，但因受五龍河谷地及萊陽盆地影響，季節(jié)性變化較大，年平均降水量801.6 mm，其中6-9月占全年降水量的75.5%，4-8月多生大霧，每年12月至次年2月是冰凍季節(jié)[1]。這些獨特的地理和氣候特點，使得青島即墨丁字灣地區(qū)潮間帶沉積物中微生物資源非常豐富。目前文獻資料里很少有關(guān)于該地區(qū)菌種資源及優(yōu)勢度的介紹。鑒于此，本研究從采集青島即墨丁字灣潮間帶沉積物樣本入手，通過沉積物中菌種的分離鑒定和優(yōu)勢度分析，對該地區(qū)菌種資源和優(yōu)勢度展開調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品

以山東省青島市即墨區(qū)丁字灣潮間帶作為采樣點(北緯36°32′38″，東經(jīng)120°51′39″)，在不同位置、不同深度采集沉積物樣品，裝入無菌密封袋，及時帶回實驗室分離細菌。

1.2 試劑和儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA，北京陸橋生物試劑有限公司)、生理生化特性微量發(fā)酵管(北京陸橋生物試劑有限公司)；Premix Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成(上海生工)；PCR儀(日本Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(日本Bio-Rad公司)；微量加樣器(Eppendorf公司)。

1.3 菌株分離純化

參照《微生物學實驗》[2]中細菌分離純化的相關(guān)規(guī)程，將沉積物樣品重懸于無菌過濾海水中，用無菌吸管吸取少量混濁液，涂布于TSA培養(yǎng)基上，30 ℃ 細菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取典型菌落，進行分離純化。

1.4 菌落形態(tài)及理化特性檢測

用接種環(huán)挑取少量細菌進行革蘭氏染色、鏡檢。將純化菌株接種于生理生化特性微量發(fā)酵管中，生理生化反應(yīng)結(jié)果參照伯杰細菌檢定手冊[3]和常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[4]，獲得細菌鑒定結(jié)果。

1.5 16S rRNA測序分析

以各純化細菌基因組DNA為模板，采用細菌16S rRNA序列擴增的通用引物(見表1)，對各細菌的16S rRNA序列進行測定。PCR反應(yīng)體系為50 μL體系(見表2)，反應(yīng)條件見表3。 吸取6 μL的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察并拍照。剩余PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測序，登陸NCBI網(wǎng)站將測序結(jié)果進行Blast比對，使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 16S rRNA序列擴增的通用引物

表2 PCR反應(yīng)體系(50 μL)

表3 PCR反應(yīng)條件

1.6 菌種種類優(yōu)勢度分析

菌種種類優(yōu)勢度計算公式：

di=Ni/N

式中：N表示所在群落的所有菌株的個體數(shù)之和，Ni表示菌株i的個體數(shù)，di表示菌株i占總物種的百分比。

di≥10%為優(yōu)勢種，1%

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

在丁字灣潮間帶共采集沉積物樣品10份，分離到細菌66株。

2.2 菌株分類鑒定

分離菌株的生理生化試驗結(jié)果如表4所示。結(jié)合生理生化特征及16S rRNA序列比對結(jié)果可知，沉積物樣品中分離到的66株細菌屬于細菌域的2個大系統(tǒng)發(fā)育類群：變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)中的2個科(Vibrionaceae和Bacillaceae))3個屬(Vibrio、Bacillus和Shewanella)。利用MEGA 4.0軟件中鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1)。

表4 菌株生理生化及革蘭氏染色試驗結(jié)果

2.3 分離菌株的優(yōu)勢度分析

青島即墨丁字灣潮間帶沉積物內(nèi)地衣芽孢桿菌(12.12%)、枯草芽孢桿菌(22.73%)和蠟狀芽孢桿菌(12.12%)屬于優(yōu)勢種，其他菌株均為常見種，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬(74.24%)。以上結(jié)果可以體現(xiàn)出青島即墨丁字灣潮間帶生境下一定的菌種資源及特點。具體如表5所示。

表4續(xù)表

表5 丁字灣潮間帶菌種資源及優(yōu)勢度結(jié)果

3 討論

潮間帶是典型的近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)，它處在陸地和海洋交界的地方，受到陸地和海洋的共同影響，因此與其他海洋環(huán)境明顯不同，所以生物多樣性及生物量極高，環(huán)境變化非常劇烈且周期性強[5]。修復和保護潮間帶生態(tài)系統(tǒng)首先需要充分了解和認識我國潮間帶的生物多樣性，才可以進一步利用和開發(fā)潮間帶資源。由于潮間帶特殊的地理環(huán)境，陸海源以及人為源的有機物首先在此發(fā)生反應(yīng)并累積，從而導致潮間帶中含有種類極為豐富的微生物。潮間帶沉積物中細菌資源及多樣性研究也越來越引起廣大專家學者的重視。王雅蘋等[6]研究了黃渤海潮間帶底棲細菌、真菌的緯度梯度分布規(guī)律，為進一步認識潮間帶微生物的多樣性及生態(tài)功能提供了理論基礎(chǔ)。國外也有學者研究發(fā)現(xiàn)在潮間帶沉積物中，含有非常多樣性的古菌，古菌基因占總量的1.6%～4.8%[7]。

本研究從青島即墨丁字灣潮間帶采集沉積物樣品，對細菌進行分離純化，共分離到細菌66株，根據(jù)生理生化實驗和16S rRNA基因序列分析，綜合鑒定分離所得細菌屬于變形菌門和厚壁菌門中的3個屬(弧菌屬、芽孢桿菌屬和希瓦氏菌屬)。青島即墨丁字灣潮間帶沉積物中枯草芽孢桿菌是最大優(yōu)勢種，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬，這與芽孢桿菌的芽孢結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。芽孢含水量極低，抗逆性強，能經(jīng)受高溫、紫外線，電離輻射以及多種化學物質(zhì)滅殺等，是生命世界中抗逆性最強的一種結(jié)構(gòu)[8-9]，因此芽孢桿菌能夠適應(yīng)潮間帶劇烈的環(huán)境變化，成為優(yōu)勢種屬。

與國外發(fā)達的海洋國家相比，我國的基礎(chǔ)海洋調(diào)查工作處于嚴重滯后的狀態(tài)，國內(nèi)在海洋微生物方面的研究薄弱，對潮間帶微生物資源的研究涉及更少。本文的研究結(jié)果顯示了青島即墨丁字灣潮間帶沉積物中具有較豐富的細菌資源，并對其優(yōu)勢度進行了分析，可為該地區(qū)潮間帶的生態(tài)系統(tǒng)研究提供相應(yīng)的參考。