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    基于生物膜干涉技術(shù)的單克隆抗體高通量定量檢測方法的建立

    2020-08-18 10:16:58車耀健劉全裕
    關(guān)鍵詞:單克隆定量抗體

    胡 妍, 羅 安, 車耀健, 劉全裕

    單克隆抗體因特異性強(qiáng)、療效顯著,其應(yīng)用正在逐步改變腫瘤治療局面[1]。通常采用瞬轉(zhuǎn)或者穩(wěn)轉(zhuǎn)的方式可獲得能分泌高效單克隆抗體的細(xì)胞株,且在挑選細(xì)胞株過程中需要對細(xì)胞表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測[2-4]。

    生物膜干涉(bio-layer interaction,BLI)技術(shù)是基于光干涉信號實(shí)現(xiàn)對生物分子快速檢測的非標(biāo)記分析檢測技術(shù),其原理為:生物傳感器底端由生物膜層覆蓋,當(dāng)生物膜層與另外一種分子接觸后,生物膜層厚度增加,接觸后,光干涉光譜位移在傳感器膜層發(fā)生變化,通過監(jiān)測位移變化,對樣品濃度進(jìn)行定量[5]。與其他蛋白檢測方法相比[6-7],BLI方法具有實(shí)時(shí)提供分析物信息、分析速度快和樣品耗量少等優(yōu)點(diǎn)[8]。Octet是基于BLI原理發(fā)展起來的商業(yè)化設(shè)備,該儀器還具有能實(shí)現(xiàn)無損檢測的優(yōu)勢[9]。

    抗體可根據(jù)結(jié)構(gòu)中是否含有Fc片段進(jìn)行分類[10-11],從而選擇不同類型的生物傳感器進(jìn)行含量測定。protein A 生物傳感器能與單克隆抗體上的Fc段特異性結(jié)合[12-13],采用浸入即讀式模式對單克隆抗體進(jìn)行濃度測定。本研究運(yùn)用BLI技術(shù),建立單克隆抗體高通量濃度定量方法,并對該檢測方法進(jìn)行方法學(xué)研究。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1儀器 分子相互作用分析儀(Octet Red 96,包括自動操作和數(shù)據(jù)分析軟件,美國Pall公司),手持式pH測量儀(SG 23,梅特勒-托利多儀器公司),電子分析天平(Practum 124-1CN,德國賽多利斯公司)。

    1.1.2試劑 自制的單克隆抗體的工作標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.6%)、雙價(jià)單鏈抗體(diabody)的工作標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.8%)由本單位提供,protein A生物傳感器(批號:1812082,美國Pall公司),96孔板(批號:E17023P8,美國Greiner bio-one公司),CD-CHO培養(yǎng)基(批號:2066133,美國Gibco公司),磷酸鹽緩沖溶液(批號:10817010,美國Corning公司),甘氨酸(批號:SLBN5537Y,美國Sigma公司),鹽酸(批號:20180122,中國國藥公司),吐溫-20(MKBS1669V,美國Sigma公司),實(shí)驗(yàn)用水為Milli-pore超純水。

    1.2方法

    1.2.1溶液配制 中和液:取100 μL吐溫-20溶液加至500 mL PBS緩沖液中,混勻;再生液(10 mmol/L甘氨酸,pH 1.7):稱取75 mg甘氨酸,加水溶解并定容至100 mL,滴加鹽酸將溶液pH調(diào)至1.7。

    1.2.2檢測條件 檢測溫度30 ℃,樣品盤轉(zhuǎn)速400 r/min,樣品與生物傳感器定量結(jié)合時(shí)間120 s,再生時(shí)間5 s,中和時(shí)間5 s,樣品或溶液量每孔200 μL。

    1.2.3檢測過程 protein A傳感器在再生液中浸泡5 s,中和液中浸泡5 s,中和、再生步驟重復(fù)3次,再在樣品溶液中浸泡120 s,對樣品進(jìn)行定量檢測,最后重復(fù)中和、再生步驟3次,用于再生和平衡傳感器。

    1.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

    1.2.4.1方法的專屬性試驗(yàn) 取表達(dá)單克隆抗體的培養(yǎng)基、細(xì)胞上清和diabody標(biāo)準(zhǔn)品3種樣品,加至96孔板中,按照1.2.2的檢測條件進(jìn)行檢測。

    1.2.4.2回歸關(guān)系考察 取500 μg/mL的單克隆抗體工作標(biāo)準(zhǔn)品,用平衡液將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋,制得7.81~500 μg/mL共7個濃度的溶液,采用1.2.2檢測條件進(jìn)行分析。

    1.2.4.3檢測限和定量限 將單克隆抗體的工作標(biāo)準(zhǔn)品不斷稀釋,采用1.2.2的檢測條件分析,以信噪比(s/n)=3時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢測限,以s/n=10時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限。另配制6份最低定量限濃度的溶液,測定樣品濃度并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

    1.2.4.4準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn) 按細(xì)胞上清與標(biāo)準(zhǔn)品體積比分別為0.5∶1,1∶1,1.5∶1的比例配制3份樣品,每份樣品重復(fù)3孔,采用1.2.2的檢測條件進(jìn)行定量分析,計(jì)算9份樣品的回收率。取細(xì)胞上清,重復(fù)6孔,加至96孔板中,進(jìn)行定量分析,計(jì)算6個樣品的精密度。由實(shí)驗(yàn)室另外兩名實(shí)驗(yàn)人員按照溶液配制方法配制溶液并按照檢測條件和檢測步驟各對6份細(xì)胞上清進(jìn)行定量檢測,計(jì)算12份樣品的中間精密度。

    1.2.4.5溶液的穩(wěn)定性和耐用性試驗(yàn) 進(jìn)行不同批次樣品濃度測定時(shí),每次在96孔板中加入150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陽性對照,得出每次陽性對照的實(shí)際值,并計(jì)算RSD以考察溶液的穩(wěn)定性。取表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞上清,按照1.2.2的檢測條件測定,記錄樣品濃度值,再分別記錄再生液pH變化±0.2、平衡液吐溫-20比例變化±5%、檢測溫度變化±5 ℃、轉(zhuǎn)盤速度變化±20%時(shí)樣品濃度值[14],每個變化條件下重復(fù)2孔,總共16次,計(jì)算這16次樣品濃度的RSD。

    1.2.4.6UPLC檢測試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[15]方法,使用Waters UPLC超高效液相色譜儀、protein A色譜柱;檢測條件為:柱溫30 ℃、檢測波長280 nm;進(jìn)樣體積為10 μL;流動相A(10 mmol/L PBS含0.15 mol/L NaCl, pH 7.2)-流動相B(0.15 mol/L NaCl, pH 2.6)進(jìn)行梯度洗脫,流速0.5 mL/min,進(jìn)而對單克隆抗體含量進(jìn)行檢測。

    1.2.4.7Octet檢測數(shù)據(jù)與UPLC-protein A檢測結(jié)果的比較試驗(yàn) 取已培養(yǎng)14 d的細(xì)胞上清溶液,分別使用Octet和UPLC檢測方法進(jìn)行定量檢測,比較兩種定量方法的檢測結(jié)果。

    2 結(jié) 果

    2.1方法的專屬性結(jié)果 protein A傳感器在表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞上清中能產(chǎn)生結(jié)合信號,在diabody標(biāo)準(zhǔn)品溶液及CD-CHO培養(yǎng)基中不產(chǎn)生結(jié)合信號,結(jié)果見圖1。單鏈抗體、培養(yǎng)基樣品的相對干涉光譜位移變化幾乎為0(bingding),而表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞上清隨著結(jié)合時(shí)間增加,厚度也隨之增加,表明protein A能特異性結(jié)合有Fc段的單克隆抗體,結(jié)合過程中不受其他類型干擾物質(zhì)的影響。

    2.2擬合結(jié)果 隨著單抗工作標(biāo)準(zhǔn)品濃度降低,其在protein A傳感器表面結(jié)合減少,使得傳感器末端厚度減小,經(jīng)計(jì)算,結(jié)合速率與濃度呈良好的擬合關(guān)系,決定系數(shù)R2為0.999 9。結(jié)果見圖2。

    2.3檢測限和定量限 當(dāng)s/n=3時(shí),單克隆抗體的檢測限為0.6 μg/mL;當(dāng)s/n=10時(shí),單克隆抗體的檢測限為2 μg/mL。6份2 μg/mL的單抗溶液的RSD為2.34%。

    2.4準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)公式:

    回收率=(加入標(biāo)品后含量-樣品含量)/加入標(biāo)品量×100%

    細(xì)胞上清與標(biāo)準(zhǔn)品分別為0.5∶1,1∶1,1.5∶1的體積比混合定量后,工作標(biāo)準(zhǔn)品的回收率98.90%~100.40%,說明該方法檢測單克隆抗體準(zhǔn)確度高,結(jié)果見表1。通過樣品的重復(fù)性考察,得RSD為2.17%,中間精密度的RSD為2.52%,說明運(yùn)用BLI技術(shù)定量檢測方法精密度高(表2)。

    表1 樣品不同添加量的回收率

    表2 精密度檢測結(jié)果

    2.5溶液的穩(wěn)定性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果 使用相同的protein A生物傳感器,樣品隔5,15,25,30和45 d分別進(jìn)樣,150 μg/mL的陽性對照樣品測試值分別為155.2,141.8,147.7,148.1,148.2 μg/mL。經(jīng)計(jì)算,陽性對照濃度值的RSD為3.7%,protein A生物傳感器重復(fù)使用60次,說明樣品溶液穩(wěn)定、傳感器可重復(fù)利用次數(shù)多。根據(jù)耐用性試驗(yàn)方法,每個變化條件下重復(fù)進(jìn)樣2次,總計(jì)16次。再生液甘氨酸pH變化±0.2、平衡液吐溫-20比例變化±5%的RSD值為0.99%,甘氨酸pH值、PBST溶液中吐溫-20含量的變化不影響檢測方法的耐用性(表3)。

    表3 耐用性檢查結(jié)果

    檢測溫度變化±5 ℃、轉(zhuǎn)盤速度變化±20%是影響樣品定量檢測的因素,轉(zhuǎn)盤速度變化-20%時(shí)對檢測結(jié)果影響最大(表4)。檢測溫度和轉(zhuǎn)盤速度的改變影響樣品與protein A傳感器的結(jié)合速率,從而影響定量結(jié)果。

    表4 考察結(jié)果的影響因素

    2.6Octet檢測結(jié)果與UPLC-protein A檢測結(jié)果的差異 分別使用Octet和UPLC-protein A兩種方法檢測25個細(xì)胞上清的表達(dá)量,Octet檢測結(jié)果與UPLC-protein A結(jié)果高度一致(R2=0.90)(圖3)。

    3 討 論

    在篩選高產(chǎn)、穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株的過程中,需快速、準(zhǔn)確地對挑選的細(xì)胞進(jìn)行定量檢測,以便對細(xì)胞株進(jìn)行篩選和排序;在挑完克隆進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)時(shí),需對蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測與監(jiān)控。本研究運(yùn)用BLI技術(shù),使用Octet分子相互作用分析儀和protein A生物傳感器,能實(shí)現(xiàn)對單克隆抗體高通量定量檢測。該種定量方法具有很多突出的優(yōu)勢,如:樣品適用性強(qiáng),分析過程不受各類培養(yǎng)基及雜質(zhì)影響;分析前,樣品不需進(jìn)行復(fù)雜的前處理步驟,收到樣品可立即檢測;分析樣品用量少、可回收;與UPLC-protein A結(jié)果比較,檢測時(shí)不需要每次都建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,節(jié)省工作標(biāo)準(zhǔn)品的消耗;UPLC-protein A檢測一個樣品需要10 min,該種定量方法能一次檢測8個樣品,每次檢測耗時(shí)約2.5 min,能在30 min檢測80個樣品的濃度,分析速度提高了27倍,實(shí)現(xiàn)對樣品的高通量檢測。

    本研究運(yùn)用BLI技術(shù),建立了高通量定量檢測單克隆抗體的方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,主要考察了專屬性、線性、檢測限和定量限、準(zhǔn)確度、精密度和中間精密度、溶液穩(wěn)定性、系統(tǒng)耐用性。結(jié)果表明,protein A傳感器能特異性地與單克隆抗體結(jié)合,不受其他雜質(zhì)干擾,抗體的濃度與結(jié)合速率之間呈良好的回歸關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9;檢測限為0.6 μg/mL,定量限為2 μg/mL;該方法準(zhǔn)確度高;重現(xiàn)性好;再生液pH、平衡液吐溫-20比例變化不影響檢測系統(tǒng)的耐用性,檢測溫度、轉(zhuǎn)盤速度變化是影響樣品定量檢測的因素。

    本研究建立的高通量定量檢測單克隆抗體濃度的方法,符合方法學(xué)驗(yàn)證要求,濃度測定結(jié)果與UPLC-protein A結(jié)果相比,有很好的可比性,同時(shí)省去樣品前處理過程,操作更簡便。在挑選高產(chǎn)細(xì)胞株時(shí),該方法能準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行定量檢測,實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞株進(jìn)行篩選、排序以及蛋白表達(dá)的檢測與監(jiān)控。

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