早發(fā)性卵巢功能不全與TGFBR3基因多態(tài)性的相關(guān)性

王松峰 瑪依熱 臘曉琳

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(烏魯木齊市，830054)

早發(fā)性卵巢功能不全(POI)為女性40歲前卵巢功能減退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂伴隨高促性腺激素和低雌激素為特征[1]，發(fā)病率為1%[2]。主要病因包括遺傳學(xué)改變、自身免疫性疾病、手術(shù)或放化療、環(huán)境因素等引起的卵巢損傷[3]。抑制素基因被認(rèn)為是POI的候選基因[4]。抑制素通過(guò)其輔助受體TGFBR3調(diào)控卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、成熟、排卵及其閉鎖[5]。由于TGFBR3基因突變可能改變其mRNA表達(dá)與結(jié)構(gòu)，失去調(diào)節(jié)促卵泡生成素作用，所以TGFBR3被預(yù)測(cè)為POI的一個(gè)潛在候選基因。新疆地區(qū)是一個(gè)有著極具特色的生態(tài)環(huán)境、流動(dòng)人口較少的相對(duì)封閉區(qū)域。有文獻(xiàn)表明TGFBR3與漢族POI發(fā)病相關(guān)[5]。但在新疆地區(qū)未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)了POI患者及正常女性TGFBR3的基因多態(tài)性，探討與POI發(fā)病的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月-2018年12月本院生殖醫(yī)學(xué)中心以不孕癥就診的已婚POI患者57例，其中漢族30例，維族27例；同期因輸卵管因素或男性因素不孕就診的月經(jīng)規(guī)律、基礎(chǔ)內(nèi)分泌6項(xiàng)正常的育齡期女性61例。POI患者中有分娩史1例為維族，12例有妊娠史(6例維族，6例漢族)。POI診斷標(biāo)準(zhǔn)：年齡<40歲，出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)>4月，兩次卵泡刺激激素(FSH)水平≥25 IU/L(兩次測(cè)定間隔4周以上)[6]。兩組均行基礎(chǔ)內(nèi)分泌6項(xiàng)、抗苗勒試管激素、竇卵監(jiān)測(cè)、染色體核型分析等。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)審批，入組對(duì)象均知情并簽署同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1基因組DNA提取采集兩組空腹靜脈血抗凝， -80℃凍存，采用蛋白酶K裂解和酚抽提法提取外周血基因組DNA。

1.2.2DNA擴(kuò)增多重PCR測(cè)定，首先根據(jù)文獻(xiàn)[7]設(shè)定TGFBR3引物序列,上游：5,-CTGAGCCTCGTGTCCAGACTC-3，，下游：5,-GCATTTTAAAAACTGGCATGTGTTTCAC-3，,擴(kuò)增18外顯子的片段為191bp，引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司提供。行多重PCR引物調(diào)整及產(chǎn)物生產(chǎn)，擴(kuò)增結(jié)束后將電泳檢測(cè)，觀察條帶是否均一，是否有雜帶等。繼續(xù)混樣、純化、稀釋，純化產(chǎn)物經(jīng)確定并稀釋到測(cè)序所需濃度。

1.2.3高通量測(cè)序①橋式PCR：使用NaOH將雙鏈DNA文庫(kù)變性為單鏈。 將單鏈DNA模板雜交到Flow Cell上。以Flow Cell 表面上的oligos為引物合成第一鏈。沖走單鏈DNA模板，以合成的第一鏈為模板進(jìn)行35循環(huán)的橋式PCR。將與P5接頭連接的DNA鏈從Flow Cell上去除。阻斷3，-OH防止在后續(xù)測(cè)序過(guò)程中繼續(xù)延伸DNA鏈。雜交測(cè)序引物。②測(cè)序反應(yīng)：橋式PCR產(chǎn)物于Illumina X-10測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序，操作流程按照標(biāo)準(zhǔn)SOP進(jìn)行。配制試劑，加樣上機(jī)行Read1測(cè)序。雜交Index測(cè)序引物行Index測(cè)序。Paired End Turnround,合成Read 2測(cè)序引物行Read 2測(cè)序。

1.2.4激素測(cè)定兩組患者均在月經(jīng)第2～3天晨取靜脈血，測(cè)定FSH、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)(試劑盒由雅培愛(ài)爾蘭診斷公司提供)，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法；抑制素B(INHB)；在經(jīng)期及非經(jīng)期檢測(cè)抗苗勒氏管激素(AMH)，試劑盒由廣州市康潤(rùn)生物科技有限公司提供，均采用酶聯(lián)免疫法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1.兩組臨床資料比較

POI組57例，年齡(33.0土0.8)歲(18～39歲)，月經(jīng)初潮年齡14.6土0.6歲，染色體核型均正常為46，XX。對(duì)照組年齡(30土0.3)歲(21～39歲)，月經(jīng)初潮年齡平均13歲，染色體核型均正常為46，XX。兩組體質(zhì)指數(shù)(BMI)、FSH、LH、AMH、INHB存在差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床特征比較

2.2 TGFBR3多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率分布

兩組1:92149139G/A與1:92149096G/A基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.325、1.98，P=0.37、0.72)，吻合度檢驗(yàn)較好(P>0.05)，符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.3 TGFBR3基因多態(tài)型和等位基因分布

對(duì)TGFBR3基因18外顯子分別測(cè)序檢出2個(gè)SNP位點(diǎn)變化，18外顯子1:92149139G/A與1:92149096G/A的基因頻率、等位基因頻率兩組存在差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組TGFBR3基因多態(tài)型和等位基因分布

3 討論

POI具有異質(zhì)性，是由遺傳、環(huán)境、免疫等因素相互作用引起，大多數(shù)病因至今仍未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)新疆地區(qū)人群TGFBR3基因多態(tài)性，探討與POI發(fā)生的相關(guān)性，以期為尋找POI的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

抑制素在女性生殖中具有內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌等作用，對(duì)FSH分泌具有選擇性抑制作用[7-8]。INHB可直接并靈敏反映早卵泡期卵巢功能。TGFBR3基因組位置1p32-33，基因組長(zhǎng)度225660bp,位置NG-027757,含有18個(gè)外顯子，是一種蛋白多酶，其胞內(nèi)段無(wú)極酶活性區(qū)，不直接參與信號(hào)傳遞，但對(duì)分子有較高親和力，可以調(diào)節(jié)TGFB與TGFBII的結(jié)合力，是一種輔助受體[9]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族存在于卵巢局部，INH也是其家族一員，通過(guò)TGFBR3受體調(diào)節(jié)垂體作用于FSH而影響卵泡發(fā)育、成熟、閉鎖[10]。由于TGFBR3基因突變可能改變它的mRNA表達(dá)與結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致與抑制素不能結(jié)合而失去調(diào)控FSH的作用。文獻(xiàn)報(bào)道[11]敲除小鼠TGFBR3基因后小鼠外表未見(jiàn)明顯改變，但生育功能明顯降低，表明TGFBR3在卵泡發(fā)育、成熟、閉鎖中的重要作用。有研究表明[12]，早發(fā)性卵巢功能不全一般先有血清INHB下降，然后FSH升高，導(dǎo)致卵泡閉鎖發(fā)生POI。有研究對(duì)54例新西蘭POI患者和對(duì)照組行TGFBR3基因11和12外顯子突變檢測(cè)，POI患者中有27例(50%)突變，對(duì)照組中有8例(19.5%)突變，兩組存在差異[13]。

本研究用Hardy-Weinberg平衡來(lái)檢測(cè)TGFBR3多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率分布，結(jié)果顯示POI組和對(duì)照組1:92149139G/A與1:92149096G/A基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，研究對(duì)象具有群體代表性。研究中TGFBR3基因18外顯子1:92149139G/A與1:92149096G/A的基因頻率、等位基因頻率在POI組與對(duì)照組均存在差異，說(shuō)明TGFBR3基因18外顯子1:92149139G/A與1:92149096G/A的多態(tài)性與POI發(fā)生可能有關(guān)。

新疆地處偏遠(yuǎn)，多民族聚居，有著本地區(qū)特有的生活習(xí)慣及婚姻習(xí)俗，環(huán)境相對(duì)封閉，遺傳變異較穩(wěn)定，有利于深入研究POI的發(fā)病機(jī)制及防治。本研究POI組與正常對(duì)照組在BMI、FSH、LH、AMH、INHB存在差異。BMI差異可能對(duì)女性卵巢功能有一定影響。有報(bào)道[5]在POI患者中發(fā)現(xiàn)抑制素和AMH主要通過(guò)調(diào)控FSH的分泌發(fā)揮其對(duì)卵泡調(diào)節(jié)作用。本研究中兩組FSH、LH、AMH、INHB存在差異也佐證了上述觀點(diǎn)；而INHB可直接并靈敏反映早卵泡期卵巢功能，可通過(guò)TGFBR3受體調(diào)節(jié)垂體對(duì)FSH作用而影響卵泡發(fā)育、成熟、閉鎖[5]。由于TGFBR3基因突變可能改變它的mRNA表達(dá)與結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致與抑制素不能結(jié)合而失去調(diào)控FSH的作用，最終導(dǎo)致POI的發(fā)生,推測(cè)其可能成為POI的一個(gè)發(fā)病因素。

目前臨床診斷POI需全面分析其相關(guān)聯(lián)基因的交互作用綜合評(píng)估，探討POI的遺傳病因，提前發(fā)現(xiàn)隱匿期POI或生化期POI，早期預(yù)防、早期干預(yù)，為臨床高危人群的遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供理論依據(jù)。