HIF-1α、VEGF、sFlt-1在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及臨床意義

王麗婷

廣東省惠州市第六人民醫(yī)院(516211)

子癇前期(PC)是一種常見的婦產(chǎn)科疾病，對(duì)胎兒及孕產(chǎn)婦身心健康和生命安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[1]。提早明確及時(shí)治療意義重大。近期，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，胎盤氧含量會(huì)直接參與滋養(yǎng)細(xì)胞生理和病理改變，而作為激活缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)可在缺氧條件下利用調(diào)節(jié)靶基因血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)轉(zhuǎn)錄參與多種與血管形成有關(guān)病理過程[2]?；诖?，本研究通過分析子癇前期患者胎盤組織中HIF-1α、VEGF、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(sFlt-1)表達(dá)，探討各因子在PC發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年6月-2018年6月本院就診的PC患者為觀察組，均符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；選取同期本院正常孕婦100例作為對(duì)照組。所有入選對(duì)象均為單胎妊娠并排除合并有精神意識(shí)障礙、心臟病、高血壓、急慢性感染以及急慢性腎病等。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，患者簽署知情意。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1標(biāo)本制備胎盤娩出后切取部分近臍帶附著處胎盤組織1cm22塊，生理鹽水漂洗，分為兩份[4]。其中一份置入4%中性多聚甲醛中固定，免疫組化測(cè)定；另一份使用無菌紗布吸水，置入RNA酶滅活凍存管置于液氮中，操作時(shí)間5min，過夜后將標(biāo)本置于低溫冰箱保存。

1.2.2免疫組化檢測(cè)將標(biāo)本常規(guī)脫水并以石蠟包埋制片，HE染色，免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)于同一條件和時(shí)間下檢測(cè)HIF-1α、VEGF、sFlt-1，儀器和試劑均選自同一生產(chǎn)公司，操作構(gòu)成均按試劑盒說明書進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液做陰性對(duì)照。所有切片均以高倍視野觀察，根據(jù)著色深淺計(jì)分：0分(-)，無著色、無陽性細(xì)胞；1分(-)，棕色或1%～25%陽性細(xì)胞；2分(+)，棕褐色或26～50%陽性細(xì)胞；3分(+ +)，深棕色或陽性細(xì)胞>50%；4分(+ +)，陽性細(xì)胞>70%；5～6分(+ + +)，陽性細(xì)胞>90%。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)引物和試劑均有同一生產(chǎn)企業(yè)提供，RT-PCR擴(kuò)增引物以及GenBank設(shè)計(jì)，以TRIzol提取胎盤組織總RNA，并取5μlPCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，將β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作參照物，測(cè)定目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料

觀察組120例，年齡(27.2±2.1)歲(23～34歲)，孕周(38.8±1.5)周(37～41周)，體質(zhì)指數(shù)(BMI)(29±2.2)kg/m2；對(duì)照組100例，年齡(27.4±2.0)歲(24～35歲)，孕周(39.0±1.1)周(38～41周)，BMI(29±2.1)kg/m2，兩組一般資料比較無差異(P>0.05)。

2.2 兩組胎盤組織中各因子蛋白免疫組化表達(dá)

觀察組HIF-1α蛋白(+ + +)、sFlt-1蛋白(+ + +)表達(dá)率高于對(duì)照組，VEGF蛋白(+ + +)表達(dá)率低于對(duì)照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組蛋白免疫組化表達(dá)對(duì)比[例(%)]

2.3 兩組胎盤組織中各因子蛋白mRNA表達(dá)

兩組VEGF mRNA表達(dá)無差異(P>0.05)； HIF-1α mRNA、sFlt-1 mRNA觀察組高于對(duì)照組，VEGF mRNA與sFlt-1 mRNA比值低于對(duì)照組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組胎盤組織中各因子mRNA表達(dá)對(duì)比

2.4 兩組HIF-1α、VEGF、sFlt-1 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析

觀察組HIF-1α mRNA與sFlt-1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.578，P<0.05)，與VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值呈相關(guān)(r=-0.382，P<0.05)。

3 討論

子癇前期為妊娠期特發(fā)疾病，與遺傳因素、免疫系統(tǒng)、胎盤缺血缺氧以及內(nèi)皮功能紊亂有一定關(guān)聯(lián)。血管重鑄障礙可引起胎盤功能不良，是導(dǎo)致子癇前期發(fā)病的主要因素。正常胎兒發(fā)育期間胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的建立受到孕早期血管生成和抗血管生成作用影響極大。HIF-1α是一種具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，在缺氧環(huán)境下可與HIF-1β亞基結(jié)合形成高度活性的二聚體，進(jìn)而穩(wěn)定缺氧反應(yīng)的表達(dá)[5]。既往研究證實(shí)，HIF-1α可以直接參與調(diào)控的靶基因包括VEGF和其受體sFlt-1以及內(nèi)皮素1等。以上因子和靶基因可直接參與機(jī)體血管的功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞能量代謝、死亡等病理生理過程，是機(jī)體對(duì)缺氧產(chǎn)生適應(yīng)和耐受的主要調(diào)節(jié)因子[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在妊娠早期絨毛組織中表達(dá)以及轉(zhuǎn)化生長因子β3的表達(dá)存在同步現(xiàn)象。即在孕5～8周時(shí)水平升高，在孕10～12周時(shí)先上升再下降[7-8]。本次研究中，觀察組HIF-1α陽性表達(dá)高于對(duì)照組且HIF-1α RNA水平升高，進(jìn)一步說明HIF-1α在mRNA及蛋白兩個(gè)水平直接參與了PC的生理病理過程。

有動(dòng)物研究表明，外源性給予孕鼠sFlt-1可誘導(dǎo)其抗血管形成，該作用又經(jīng)VEGF作用所糾正[9]。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在孕早期主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞，而在孕中晚期主要分泌于合體滋養(yǎng)細(xì)胞，且可通過旁分泌調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞代謝。此外，VEGF作為一種血管誘生因子，在妊娠早期可直接參與胎盤血管網(wǎng)的形成，對(duì)胎兒的正常發(fā)育有著重要影響。既往研究大多初步證實(shí)VEGF在妊娠高血壓患者胎盤組織中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；正常妊娠胎盤生長過程中有促進(jìn)血管生長、增殖和浸潤作用，同時(shí)可修復(fù)受損血管。VEGF降低則直接影響血管內(nèi)皮功能，胎盤功能狀態(tài)也較差。李玉芳[11]等學(xué)者在VEGF及其受體SFLT-1水平與重度子癇前期孕婦新生兒結(jié)局的關(guān)系探討中發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期患者VEGF及其受體SFLT-1與正常孕婦存在明顯差異,高水平SFLT-1會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷,是造成新生兒體重過低、血壓升高和蛋白尿的關(guān)鍵因素。本次研究發(fā)現(xiàn)，觀察組VEGF陽性表達(dá)率較對(duì)照組更低，兩組VEGF mRNA表達(dá)無明顯差異，提示VEGF主要通過VEGFR-1通路實(shí)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞分泌NO以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控。也有研究認(rèn)為胎盤組織VEGRFR-1表達(dá)上調(diào)可改變VEGF調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞功能。VEGF在PC中的機(jī)制還需深入研究。

大量研究顯示sFlt-1可通過sFlt直接參與血管形成和胎盤絨毛浸潤[12]，滋養(yǎng)細(xì)胞中，sFlt可刺激NO合成并抑制滋養(yǎng)細(xì)胞DNA的合成，進(jìn)而對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤產(chǎn)生影響[13-14]。由于分子量較小的蛋白可通過腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間隙隨尿液排泄，而子癇前期孕婦存在腎小球血管內(nèi)皮損傷，細(xì)胞間隙加大，因此血清檢查亦可見明顯的sFlt-1水平變化[15]。王東艷[16]等學(xué)者在研究中通過分析Endoglin、VEGF及Flt-1在子癇前期患者胎盤組織中的變化發(fā)現(xiàn)，PC患者胎盤組織中Endoglin和Flt-1蛋白表達(dá)升高,VEGF蛋白表達(dá)降低,Endoglin、VEGF及Flt-1的變化與子癇前期的病癥有密切關(guān)系。而本次研究發(fā)現(xiàn)，觀察組sFlt-1 mRNA明顯高于對(duì)照組且與HIF-1α mRNA呈正相關(guān)關(guān)系。推測(cè)，PC胎盤組織中激活的HIF-1αm可在一定程度上促進(jìn)下游基因sFlt-1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而加重PC的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，HIF-1α在PC胎盤組織中可通過調(diào)節(jié)下游VEGF和sFlt-1的轉(zhuǎn)錄對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤產(chǎn)生影響，進(jìn)而參與PC的發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需深入研究。