miR-223-3p和LIF在子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)意義

胡 泉 徐 嵐

湖北省咸寧市中心醫(yī)院，湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院(437000)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是引起不孕的主要原因之一[1]。發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情多變，形態(tài)多樣。部分患者伴有浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)病變，為臨床治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。miRNAs參與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡過程[2]。研究報(bào)道，miR-223-3p可通過調(diào)控STIM1基因，調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖與凋亡[3]?？赏ㄟ^調(diào)控IGF-1R基因促進(jìn)慢性免疫性疾病中CD8+T細(xì)胞的凋亡[4]。不孕婦女多存在著床因子缺陷，而白血病抑制因子(LIF)與不孕癥的發(fā)生關(guān)系密切[5]。但關(guān)于miR-223-3p與LIF在EMs引起的不孕表達(dá)及調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。本研究對(duì)此進(jìn)行分析，以期為治療EMs不孕癥提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年2月-2018年2月本院治療的EMs并發(fā)不孕患者22例為異位癥組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：腹腔鏡檢查或B超提示卵巢區(qū)有液囊，穿刺液囊證實(shí)為巧克力囊腫。均經(jīng)腹腔鏡檢查，且按照美國(guó)生殖學(xué)會(huì)(AFS)分期法分期1～2期，月經(jīng)周期正常，排除其他因素引起的不孕。納入標(biāo)準(zhǔn)：①月經(jīng)周期正常，近3個(gè)月未使用過類固醇激素；②B超檢查正常排卵；③患者知情且簽署同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫性疾病；②有慢性婦科疾??；③合并惡性腫瘤；④臨床資料不完整。另選同期本院月經(jīng)周期正常的已婚婦女25例為對(duì)照組，其中9例為絕育手術(shù)者、6例為絕育術(shù)后再通、4例為單純卵巢囊腫，6例為子宮肌瘤，患者均行剖宮手術(shù)或腹腔鏡手術(shù)時(shí)排除子宮內(nèi)膜異位癥。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1樣本采集取患者黃體中期(月經(jīng)周期19～24天)子宮內(nèi)膜，錫紙包裹后貯存于液氮中待檢。

1.2.2miR-223-3p和LIFmRNA表達(dá)量檢測(cè)采用qRT-PCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中miR-223-3p與LIF mRNA相對(duì)表達(dá)量。取子宮內(nèi)膜組織樣本50mg，加入Trizol勻漿，提取組織總RNA；以RNA為模板，將2 ugRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用Real Master Mix試劑盒(Promega公司)進(jìn)行qRT-PCR， qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，ddH2O 6.8 μl；熒光定量PCR儀程序設(shè)定為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。其中miR-223-3p以U6為內(nèi)參基因，LIF以β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，對(duì)所得Ct值分析， 2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3LIF蛋白表達(dá)檢測(cè)甲醛溶液固定子宮內(nèi)膜組織，制作石蠟切片，脫蠟、水化；加3% H2O2溶液室溫孵育10min抗原熱修復(fù)，以山羊血清封閉10 min；加入LIF單克隆抗體(1:500)，4 ℃孵育12 h，PBS洗3次×5min；加酶標(biāo)二抗特異性結(jié)合一抗，室溫孵育20 min，PBS洗3次×5min；洗滌后滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染并不同梯度乙醇中脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察，Axioplan 2 imaging 顯微圖像分析系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

異位癥組不孕時(shí)間(4.1±2.3年)、年齡(28.3±5.3歲)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)(4.73±1.21 IU/ml)與對(duì)照組未生育時(shí)間(4.5 ±2.5年)、年齡(30.5 ±4.9歲)，F(xiàn)SH(4.81±1.13 IU/ml)比較均無差異(P>0.05)。

2.2 各組miR-223-3p和LIF mRNA表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，異位癥組miR-223-3p mRNA表達(dá)水平(5.63±0.17)高于對(duì)照組(1.02±0.09)，LIF mRNA表達(dá)(0.40±0.08)低于對(duì)照組(1.19±0.13)(t=113.83、25.423，均P<0.001)。

2.3 各組LIF的蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示， LIF蛋白在對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織呈陽性表達(dá)，且胞核與胞質(zhì)均有明顯棕黃色著色，胞核著色為主，LIF蛋白陽性表達(dá)與LIF mRNA水平一致。LIF蛋白在異位癥組表達(dá)較弱，且在不同患者中陽性表達(dá)水平有差異。采用Imaje J系統(tǒng)分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組(3.65±0.81)高于異位癥組(1.38±0.42)(P<0.05)。見圖1(見插頁)。

2.4 miR-223-3p生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-223-3p靶基因預(yù)測(cè)顯示，LIF基因上有microRNA-223-3p結(jié)合位點(diǎn)，提示LIF可能是microRNA-223-3p的潛在靶基因。見圖2。

圖2 microRNA-223-3p與LIF的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 miR-223-3p與LIF的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，異位癥組miR-223-3p表達(dá)與LIF表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.625,P=0.002)。見圖3。

圖3 miR-223-3p與LIF 相關(guān)性

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確[6-7]。主要有腹膜型、卵巢型、深部浸潤(rùn)型等，盆腔以卵巢型及腹膜型較多見，且重癥患者多伴發(fā)幾種類型[8]。經(jīng)血逆流易導(dǎo)致腹膜型EMs，繼發(fā)卵巢粘連，進(jìn)一步侵襲卵巢導(dǎo)致卵巢巧克力囊腫發(fā)生，引起患者不孕[9]。

內(nèi)膜異位癥引起不孕主要是引起盆腔局部解剖結(jié)構(gòu)改變及輸卵管黏連堵塞，導(dǎo)致受精過程受阻；另外引起多種內(nèi)分泌激素異常而影響卵泡發(fā)育、成熟及排卵[10]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜異位癥引起的不孕與子宮內(nèi)膜容受性下降引起著床失敗關(guān)系密切，LIF、整合素是目前公認(rèn)的與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子。研究表明microRNA-223-3p可通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究對(duì)microRNA-223-3p靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LIF基因上有microRNA-223-3p結(jié)合位點(diǎn)，提示LIF是microRNA-223-3p的潛在靶基因。董熙遠(yuǎn)等報(bào)道，microRNA-223-3p通過抑制LIF的表達(dá)和胞飲突的形成，在胚胎置入中發(fā)揮重要作用[11]。但關(guān)于microRNA-223-3p是否調(diào)控LIF蛋白的表達(dá)而參與內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展未見報(bào)道。

miR-223-3p作為新型生物學(xué)標(biāo)志物，其在炎癥反應(yīng)、癌癥、血小板活化、血管新生等機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]；可通過調(diào)控靶基因IL6ST的表達(dá)，抑制LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)[13]。胚胎著床主要依賴于胚胎與接受性子宮內(nèi)膜的同步發(fā)展，而LIF是影響子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵因子。研究報(bào)道，miR-223-3p抑制小鼠胚胎植入過程中LIF的表達(dá)，影響小鼠胚胎的植入[14]。本研究結(jié)果顯示，異位癥組miR-223-3p的mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，提示異位癥不孕發(fā)生可能與miR-223-3p表達(dá)水平升高有關(guān)。

LIF是白細(xì)胞介素6(IL-6)家族一員，具有多種生物活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LIF培養(yǎng)液可促進(jìn)胚胎發(fā)育，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)，加速胚胎孵化[15]。研究報(bào)道，正常子宮內(nèi)膜中LIF的表達(dá)在種植窗口期達(dá)到峰值，而異位癥患者表達(dá)有缺陷。異位癥患者及不孕患者的子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)水平低于同期正常婦女表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，異位癥組LIF mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，提示低水平LIF引起了異位癥不孕發(fā)生。Pearson相關(guān)性分析顯示，異位癥組miR-223-3p表達(dá)與LIF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-223-3p可能通過抑制LIF表達(dá)減弱子宮內(nèi)膜容受性而引起不孕。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜異位癥中miR-223-3p高表達(dá)、LIF低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-223-3p可能通過抑制LIF的表達(dá)引起不孕。本研究存在一定不足之處，關(guān)于miR-223-3p與LIF在EMs發(fā)生過程中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。