不同劑量天葵顆粒對(duì)腎虛血瘀型子宮內(nèi)膜容受性不良模型大鼠血清性激素、VEGF、ITG-β3及胚胎著床影響

李虹秀 毛 惠 吳 敏

1.西南醫(yī)科大學(xué)(瀘州，646000);2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院

子宮內(nèi)膜在胚胎著床及妊娠過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，其容受性決定著接受胚胎著床的能力[1]。近年來(lái)我國(guó)育齡女性的不孕癥發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[2]，雖然大部分不孕癥是排卵障礙導(dǎo)致[3]，但子宮內(nèi)膜容受性不良也會(huì)引起不孕癥[4]。西藥雖然在治療促排卵療效較顯著，但可能會(huì)引起肝腎功能損傷[5]。中醫(yī)認(rèn)為，女子以血為本，氣滯血瘀、瘀阻沖任、氣血運(yùn)行受阻則種子艱難，因此補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血活血是治療子宮內(nèi)膜容受性不良的關(guān)鍵[6]。天葵顆粒是根據(jù)《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》壽胎丸加減而成的溫腎活血顆粒劑，在治療排卵障礙性不孕癥方面有很好療效[7]，但在子宮內(nèi)膜容受性不良引起的不孕癥治療的相關(guān)研究較少。因此本研究通過(guò)建立腎虛血瘀型子宮內(nèi)膜容受性不良模型大鼠，用不同劑量的天葵顆粒進(jìn)行治療，觀察其對(duì)內(nèi)膜病理結(jié)構(gòu)、孕激素水平、子宮著床胚泡數(shù)及子宮體血供情況。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源

選取SPF級(jí)性成熟雌性SD大鼠96只，體重200～220 g；同品系成年雄性大鼠48只，體重250～280 g，均購(gòu)于成都達(dá)碩，合格證號(hào)[SCXK(川)2015-030]。雌、雄大鼠于實(shí)驗(yàn)前1周購(gòu)入適應(yīng)性飼養(yǎng)，雌雄分籠飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房[SYXK(川)2018-065]。培育室溫度20～25℃，濕度65%～70%，人工光照(12 h/晝、12 h/夜)，大鼠全天自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格遵循“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器

天葵顆粒(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，川藥制字：Z20080326)；戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè)，DELPHARMLille S.A.S.制藥，H20080108)；羥基脲片(齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，H37021289)；鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，H12020526)；雌激素(E2)、孕酮(P)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(茁彩生產(chǎn))；兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)；兔抗大鼠整合素-β3(ITG-β3)多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；二抗及相應(yīng)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國(guó))；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，每日清晨行陰道涂片，以動(dòng)情期規(guī)律為入組標(biāo)準(zhǔn)篩選96只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表分組法分為6組：空白組、模型組、天葵顆粒低、中、高劑量組、補(bǔ)佳樂(lè)組，每組16只。

1.3.2造模及給藥參照文獻(xiàn)[8]造模方法建立腎虛血瘀模型。除空白組外各組每天按照450 mg/kg上午灌服造模藥羥基脲，下午灌服受試藥物，第4 d開始加用腎上腺素0.104 mg/kg/d皮下注射7 d。天葵顆粒低、中、高劑量組分別給予3.125、6.25、12.5 g/kg中藥懸混液0.5 ml灌胃(相當(dāng)成人等效劑量、2倍、4倍等效劑量)，補(bǔ)佳樂(lè)組灌服0.3 mg/kg的戊酸雌二醇片，1次/d，空白組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)10 d。造模結(jié)束后，各組大鼠每日18：00按雌雄2：1合籠，第2 d 8：00行陰道涂片觀察，發(fā)現(xiàn)精栓則計(jì)為妊娠第1 d，分別于妊娠第5、8 d 9:00，各組隨機(jī)抽取8只，用10%水合氯醛麻醉后取腹主動(dòng)脈血液，斷頭處死后剖離子宮體。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目

妊娠第5天：①將腹主動(dòng)脈血液離心取上清，ELISA法檢測(cè)E2、P水平；②將剝離的子宮體甲醛固定，石蠟包埋制成切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化與子宮內(nèi)膜血管分布情況，采用圖像分析軟件Motic Images Advanced 3.2測(cè)量計(jì)數(shù)血管數(shù)；③采用免疫組化處理子宮切片，光鏡下觀察切片，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色或棕黃色。采用Image-Pro Plus 6.0對(duì)每個(gè)組織的400倍下3張照片進(jìn)行光密度值分析，測(cè)定子宮內(nèi)膜VEGF及ITGβ3的表達(dá)量，得出每個(gè)視野的平均光密度值(平均光密度值與VEGF和KDR的表達(dá)量成正比)。妊娠第8天：計(jì)數(shù)孕鼠數(shù)及著床卵泡數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

空白組大鼠一般情況良好，毛色光滑，反應(yīng)靈活，體質(zhì)量呈穩(wěn)步增長(zhǎng)，大便正常；模型組大鼠出現(xiàn)拱背，蜷縮少動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，皮毛疏松毛躁、脫毛，大便偏稀，甚至便溏等；補(bǔ)佳樂(lè)組和天葵顆粒高劑量組一般情況與空白組類似，天葵顆粒中、低劑量組大鼠一般情況介于空白組與模型組之間。

2.2 大鼠子宮內(nèi)膜病理及血管數(shù)變化

HE染色結(jié)果顯示：空白組大鼠妊娠第5d時(shí)子宮內(nèi)膜組織內(nèi)膜、肌層和外膜結(jié)構(gòu)清晰，子宮內(nèi)膜較為完整，子宮腺上皮細(xì)胞形態(tài)正常，胞核大而圓，核仁明顯，子宮腺未見(jiàn)明顯擴(kuò)張，肌層肌纖維平行排列，整齊、致密；漿膜層單層間皮細(xì)胞及薄層疏松結(jié)締組織結(jié)構(gòu)完整清晰，血管豐富。與空白組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜增生，見(jiàn)內(nèi)膜增厚，細(xì)胞成分明顯增多，少量子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞壞死，見(jiàn)胞質(zhì)空泡化，胞核溶解；子宮腺短、直而細(xì)、排列稀疏，子宮腺上皮細(xì)胞壞死，固有層間質(zhì)內(nèi)極少量至少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，血管數(shù)量明顯減少(P<0.001)。與模型組比較，天葵顆粒高、中劑量組、補(bǔ)佳樂(lè)組大鼠子宮內(nèi)膜、肌層和外膜結(jié)構(gòu)清晰，子宮內(nèi)膜較為完整，部分子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞空泡變性；固有層內(nèi)含子宮腺，腺上皮細(xì)胞排列規(guī)則，子宮腺未見(jiàn)明顯擴(kuò)張，固有層間質(zhì)內(nèi)少量或極少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，包括淋巴細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞；肌層肌纖維平行排列，整齊、致密；漿膜層單層間皮細(xì)胞及薄層疏松結(jié)締組織結(jié)構(gòu)完整清晰，內(nèi)膜組織血管增加(P<0.001)。見(jiàn)圖1(見(jiàn)插頁(yè))、表1。

2.3 大鼠血清激素水平變化

妊娠第5 d時(shí)，與空白組相比，模型組大鼠血清E2、P水平降低，補(bǔ)佳樂(lè)和高、中劑量組血清E2、P水平升高(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各觀察指標(biāo)比較(n=8)

2.4 大鼠子宮內(nèi)膜組織中VEGF、ITG-β3表達(dá)變化

免疫組化結(jié)果顯示，VEGF空白組中可見(jiàn)大量褐色細(xì)胞，VEGF陽(yáng)性表達(dá)率高；ITG-β3空白組部分染成褐色細(xì)胞，而模型組中VEGF及ITG-β3褐色細(xì)胞數(shù)目減少，補(bǔ)佳樂(lè)及不同劑量天葵顆粒組褐色細(xì)胞數(shù)明顯增多，且與天葵顆粒呈劑量依賴；妊娠第5天時(shí)，與空白組相比，模型組VEGF、ITG-β3平均光密度降低，補(bǔ)佳樂(lè)和高、中、低劑量天葵顆粒劑量組VEGF、ITG-β3平均光密度高于模型組(P<0.01)。見(jiàn)圖2、3(見(jiàn)插頁(yè))，表1。

2.5 大鼠妊娠及胚泡著床變化

妊娠第8 d時(shí)，對(duì)各組大鼠胚泡著床肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，空白組子宮著床胚泡數(shù)較多，胚泡呈串珠狀隆起，兩側(cè)子宮胚泡大小、數(shù)量均勻，子宮體紅潤(rùn)，血供佳；模型組子宮著床胚泡數(shù)較少，分布稀疏，胚泡體積小于空白組，可見(jiàn)被吸收胚泡的痕跡，子宮體蒼白，血供差；天葵顆粒高、中劑量及補(bǔ)佳樂(lè)組胚泡著床數(shù)大于模型組，兩側(cè)子宮胚泡大小、數(shù)量較均勻，血供尚可。各組大鼠的著床率無(wú)差異(P>0.05)，與空白組相比，模型組著床胚泡數(shù)降低，補(bǔ)佳樂(lè)和天葵顆粒高、中、低劑量天葵顆粒組著床胚泡數(shù)高于模型組(P<0.01)。見(jiàn)圖4(見(jiàn)插頁(yè))，表1。

3 討論

西藥促排卵往往會(huì)使患者激素代謝紊亂，降低子宮內(nèi)膜容受性，引起妊娠率下降[9]。中醫(yī)沒(méi)有“子宮內(nèi)膜容受性”的相關(guān)記載，但子宮內(nèi)膜容受性不良在臨床多表現(xiàn)為不孕，中醫(yī)以“腎-天癸-沖任-胞宮”調(diào)節(jié)軸來(lái)反應(yīng)女性的生殖情況[10]，腎乃先天之本，主藏精，生天癸，主生殖，為沖任之本，孕胎之根，如果腎氣虛弱，早配頻產(chǎn)，引起精血耗傷，外加七情內(nèi)傷，導(dǎo)致氣滯血瘀，淤滯沖任，更難攝精受孕。隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)不管是腎陰虛還是腎陽(yáng)虛均會(huì)引起血瘀型的病理表現(xiàn)[11]。本研究建立了符合中醫(yī)特征的腎虛血瘀型子宮內(nèi)膜容受性不良大鼠模型，其子宮內(nèi)膜病理組織切片結(jié)果顯示，細(xì)胞成分明顯增多，少量上皮細(xì)胞死亡，且胞質(zhì)空泡化、核膜溶解較多，最主要是血管數(shù)量顯著減少，且子宮內(nèi)膜組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率也顯著降低；而經(jīng)過(guò)中、高劑量的天葵顆粒處理后，子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)與空白組基本一致，且血管數(shù)量增多，子宮內(nèi)膜組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率升高。子宮內(nèi)膜中血管數(shù)量減少及血供不足均引起子宮內(nèi)膜容受性降低，可能與天葵顆粒中主要成分淫羊藿和紅花有關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，淫羊藿中的黃酮甙具有擴(kuò)張外周血管的功能[12]，而紅花中的黃色素可以改善血液微循環(huán)[13]，二者均有利于緩解模型大鼠子宮內(nèi)膜血管數(shù)量減少及血運(yùn)不足等情況。

孕激素是影響子宮內(nèi)膜分泌功能、誘導(dǎo)內(nèi)膜蛻膜化及允許胚胎植入的最主要因素之一[14]。子宮內(nèi)膜的發(fā)育必須與卵泡發(fā)育、排卵同步進(jìn)行才具備胚胎植入能力，當(dāng)機(jī)體受孕后，其血清中E2及P均升高，促進(jìn)子宮肌細(xì)胞增生肥大，增進(jìn)血運(yùn)，為妊娠最好準(zhǔn)備[15]；ITG-β3通常會(huì)在著床期開放時(shí)在子宮內(nèi)膜腺上皮及子宮內(nèi)膜上皮中高表達(dá)，促進(jìn)孕卵著床[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清E2、P水平降低，子宮內(nèi)膜ITG-β3陽(yáng)性表達(dá)率降低，中、高劑量天葵顆粒處理組血清E2、P水平升高，子宮內(nèi)膜ITG-β3陽(yáng)性表達(dá)率升高，這可能是因?yàn)樵屑に厮捷^低，無(wú)法刺激ITG-β3的表達(dá)，不利于孕卵著床；而天葵顆粒中的主要成分菟絲子、桑寄生等具有加強(qiáng)垂體-卵巢促黃體功能，還可以誘導(dǎo)雌激素樣活化促進(jìn)子宮發(fā)育[17-18]。本研究對(duì)胚泡著床肉眼觀察到，模型組著床胚泡數(shù)較少，且分布較稀疏，且胚泡吸收痕跡明顯，子宮體顏色蒼白血供不足，天葵顆粒治療組子宮著床胚泡數(shù)增多，且呈現(xiàn)劑量關(guān)系，血供與對(duì)照組相似，證實(shí)天葵顆粒具有的溫腎活血之功效。

綜上所述，腎虛血瘀作為無(wú)排卵障礙性不孕癥的主要病機(jī)，溫腎活血是治療根本。天葵顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生長(zhǎng)而改善子宮內(nèi)膜血供同時(shí)促進(jìn)E2、P等激素合成，上調(diào)ITG-β3表達(dá)，促進(jìn)著床窗開放，提高孕卵著床率，最終發(fā)揮調(diào)經(jīng)助孕之功效。