破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究進(jìn)展

葉會(huì)科，王秋珍，何耀東，汪光義

（1 天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300072；2 天津大學(xué)青島海洋技術(shù)研究院，山東青島266200；3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島066000）

二十二碳六烯酸（DHA）是目前發(fā)現(xiàn)的碳鏈最長(zhǎng)的ω-3 多不飽和脂肪酸，具有抗心腦血管疾病、抗血脂、降血壓、預(yù)防各種癌癥等功效，參與炎癥反應(yīng)、血液凝結(jié)等重要的生理過(guò)程，同時(shí)在嬰幼兒視網(wǎng)膜形成、神經(jīng)發(fā)育、智力發(fā)育等方面起著關(guān)鍵作用[1-2]。深海魚(yú)油是DHA 的傳統(tǒng)來(lái)源，但其存在成本高、重金屬污染等缺點(diǎn)[3]。同時(shí)，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)深海魚(yú)類(lèi)等高等生物并不能直接合成DHA，而是通過(guò)外界攝取來(lái)獲取DHA[4]。因此，越來(lái)越多的研究人員將研究方向聚焦于海洋食物鏈的初級(jí)生產(chǎn)者——海洋藻類(lèi)和海洋微生物上。海洋微生物由于具有生長(zhǎng)周期短、不受季節(jié)限制等優(yōu)勢(shì)，成為DHA 等多不飽和脂肪酸的重要來(lái)源[5]。能夠生產(chǎn)DHA的海洋微生物主要是一些低等的海洋真菌、微藻和原生生物等，其中破囊壺菌由于具有生長(zhǎng)速度快、油脂含量高、易于培養(yǎng)等諸多優(yōu)勢(shì)，成為目前工業(yè)化生產(chǎn)DHA 的理想物種之一[6]。

1 破囊壺菌概述

破囊壺菌（thraustochytrids）是一類(lèi)分布于海水、半咸水、腐爛紅樹(shù)葉及藻類(lèi)等特定環(huán)境中的類(lèi)真菌類(lèi)原生生物[7]。大多數(shù)破囊壺菌在腐爛的植物和藻類(lèi)的殘?jiān)线M(jìn)行腐生，少數(shù)寄生于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物[8]。早在1934年就已經(jīng)有科學(xué)家分離出了破囊壺菌，因其可產(chǎn)生雙鞭毛的浮游孢子，破囊壺菌在發(fā)現(xiàn)的初期 被 分 類(lèi) 為 真 菌 界（Eumycetes）、 卵 菌 綱（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）[9-10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)破囊壺菌并不屬于真菌，在進(jìn)化距離上與盤(pán)根足蟲(chóng)更為相近。因此，破囊壺菌最終被列為生物界（stramenopila）、不等毛門(mén)（heterokonta）、網(wǎng)黏菌綱（labyrinthulomycetes）、破囊壺菌目（thraustochytriales）、破囊壺菌科（thraustochytriaceae）[11-12]。根據(jù)最新的分子分類(lèi)學(xué)研究， 破囊壺菌共包括9 個(gè)屬， 分別為Aurantiochytrium、Thraustochytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、Sicyoidochytrium、Japonochytrium、Ulkenia 和Schizochytrium、Monorhizochytrium[13]。本實(shí)驗(yàn)室在我國(guó)的諸多海域均使用松花粉垂釣法分離出了多株破囊壺菌，并對(duì)相關(guān)海域的可培養(yǎng)破囊壺菌多樣性進(jìn)行了分析，揭示了破囊壺菌的高產(chǎn)油特性，是發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸的潛力菌[14]。

破囊壺菌細(xì)胞所含油脂中的脂肪酸成分簡(jiǎn)單，主要是棕櫚酸（C16∶0）和DHA[14]，已被證實(shí)為理想的DHA 工業(yè)化生產(chǎn)菌，表1 對(duì)現(xiàn)階段研究較多的可用于生產(chǎn)DHA 的破囊壺菌菌株進(jìn)行了總結(jié)。早 在2003 年Bailey 等[16]在14000 加侖（1 加 侖=3.7854118L） 的發(fā)酵罐中使用Schizochytriumsp.ATCC20888，獲得了171.5g/L的生物量，且其DHA產(chǎn)量可達(dá)35.33g/L，2004年美國(guó)的Martek公司就已經(jīng)將破囊壺菌中的Schizochytruimsp.進(jìn)行商業(yè)化利用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)DHA[23]；國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者于2013 年，在7000L 的發(fā)酵罐中使用Schizochytriumsp.CCTCC M209059 可獲得生物量128.3g/L，DHA 產(chǎn)量達(dá)39.2g/L[15]。破囊壺菌油脂中的飽和脂肪酸棕櫚酸可作為生物柴油的主要原料，因而使其成為極具研究?jī)r(jià)值的能源微生物[24]。此外，破囊壺菌細(xì)胞內(nèi)含有的其他活性成分，如類(lèi)胡蘿卜素、角鯊烯等萜類(lèi)物質(zhì)[7,25]對(duì)人體健康有著至關(guān)重要的作用。破囊壺菌具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，目前已被證明可用于海參等諸多海產(chǎn)生物幼體的培育。使用添加破囊壺菌菌體的飼料，不僅可以降低幼體的發(fā)病率，提高免疫力和成活率，還能使其體重和肉質(zhì)中的DHA 比例增加，從而提升產(chǎn)品品質(zhì)和市場(chǎng)價(jià)值[26-27]。因此，開(kāi)發(fā)破囊壺菌高附加值代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

表1 現(xiàn)階段研究較多生產(chǎn)DHA的破囊壺菌菌株匯總

2 破囊壺菌DHA合成路徑

目前破囊壺菌生物合成DHA 的代謝途徑并不明確，一般認(rèn)為破囊壺菌可以通過(guò)兩種途徑合成DHA，即傳統(tǒng)的脂肪酸合成酶（fatty acid synthesis pathway，F(xiàn)AS）和聚酮合酶（polyketide synthesis pathway，PKS）[28-29]。本文作者課題組在最近的研究中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析了Thraustochytriidaesp.PKU#Mn16利用葡萄糖或甘油兩種單一碳源以及兩種混合碳源的DHA 合成通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與利用葡萄糖為碳源時(shí)相比，當(dāng)利用混合碳源時(shí)其FAS通路相應(yīng)基因有所上調(diào)；而與甘油為碳源相比，當(dāng)利用混合碳源時(shí)，其PKS 路徑上的相應(yīng)基因有所上調(diào)，這表明兩個(gè)DHA合成路徑同時(shí)存在于破囊壺菌中，且與外界營(yíng)養(yǎng)條件有密切關(guān)系[20]。在合成脂肪酸的過(guò)程中，兩條途徑均以乙酰CoA和丙二酸單酰CoA為基本合成單位，同時(shí)碳鏈延伸的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)也一致，但兩者所涉及的關(guān)鍵酶不同。此外，與FAS途徑相比，PKS途徑具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：①不飽和脂肪酸直接由乙酰輔酶A合成，并不是首先合成飽和脂肪酸再由去飽和酶形成雙鍵；②在整個(gè)合成路徑中并不需要氧氣的參與，但在有氧條件下PKS途徑依然可以運(yùn)行，只是氧分子不參與反應(yīng)[30]。

2.1 脂肪酸合成酶（FAS）途徑

傳統(tǒng)的脂肪酸合成酶（fatty acid synthesis pathway，F(xiàn)AS）途徑主要通過(guò)碳鏈的延伸和去飽和作用而合成DHA。其中FAS 是一個(gè)多酶復(fù)合體，包括?；D(zhuǎn)移酶、烯酰ACP 還原酶、脫水酶、酮酰ACP 還原酶、酮酰ACP 合成酶、磷酸泛巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶和酰基載體蛋白ACP，以及其他的一些輔酶[23]。破囊壺菌通過(guò)FAS 途徑合成DHA 的過(guò)程如圖1所示。

圖1 破囊壺菌合成多不飽和脂肪酸的FAS通路

破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA 較常用的碳源是葡萄糖和甘油，而這兩種碳源必須經(jīng)過(guò)糖酵解途徑代謝為丙酮酸，再由丙酮酸氧化為乙酰輔酶A才能夠進(jìn)入脂肪酸合成途徑。在微生物體內(nèi)，葡萄糖首先經(jīng)過(guò)糖酵解途徑（EMP）或磷酸戊糖途徑（HMP）被代謝為丙酮酸。甘油進(jìn)入微生物體內(nèi)后首先在甘油激酶（GK）的催化下磷酸化為3-磷酸甘油，再通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的FAD+依賴(lài)型的3-磷酸甘油脫氫酶（FAD+-G-3-PDH）轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮，隨后進(jìn)入EMP 途徑[31]。其中，HMP 途徑不直接為生物體提供能量，但是能夠?yàn)橹舅岽x提供一系列的前體物質(zhì)（NADPH、核酸等）。在有氧條件下，丙酮酸在線粒體中被完全氧化為乙酰輔酶A。脂肪酸合成的前體物質(zhì)是乙酰輔酶A，微生物可利用體內(nèi)的乙酰輔酶A在FAS的作用下通過(guò)一系列的生物化學(xué)反應(yīng)合成軟脂酸（16∶0）[32]。這一系列的反應(yīng)包括乙?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、丙二酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)、脫水反應(yīng)、縮合反應(yīng)以及還原反應(yīng)。而軟脂酸可以在碳鏈延長(zhǎng)酶的作用下生成硬脂酸（C18∶0），隨后在△9 去飽和酶的作用下生成油酸（OA，18∶1）、△9和△12 去飽和酶的作用下生成亞油酸（LA，18∶2）、△9、△12和△15去飽和酶作用下生成亞麻酸（ALA，18∶3）[33]。亞油酸（LA，18∶2）和亞麻酸（ALA，18∶3）分別進(jìn)入n-6和n-3脂肪酸合成途徑，隨后在△6、△5和△4去飽和酶以及延長(zhǎng)酶的交替作用下分別生成DHA（二十二碳六烯酸）和DPA（二十二碳五烯酸）[34]。目前，在整個(gè)合成路徑中，△4-去飽和酶[35]、△5-延長(zhǎng)酶[36]、△12-去飽和酶[37]和△5-去飽和酶[38]已經(jīng)被克隆并鑒定，其他去飽和酶和延長(zhǎng)酶尚未被鑒定。

Hauvermale 等[39]從S.sp.ATCC20888 的 基 因 組DNA中分離出3個(gè)編碼多不飽和脂肪酸合成酶亞基的基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，在得到的轉(zhuǎn)化子中積累了DHA和DPA，且DHA/DPA的比值與裂殖壺菌中的比值大致相同；Metz 等[40]對(duì)S. sp.ATCC20888 的FAS 合成酶基因定點(diǎn)突變后，發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌只能合成飽和脂肪酸，而無(wú)法合成DHA。這些研究表明在破囊壺菌體內(nèi)存在FAS路徑的相關(guān)基因，一旦相關(guān)基因被干擾，其DHA 合成就會(huì)受到影響。對(duì)該途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行進(jìn)一步的研究，更有利于對(duì)破囊壺菌生產(chǎn)DHA進(jìn)行代謝調(diào)控。

2.2 聚酮合酶（PKS）途徑

有研究發(fā)現(xiàn)破囊壺菌科中的裂殖壺菌不能將外源14C 標(biāo)記的C22∶5 轉(zhuǎn)化成DHA，因此，推測(cè)破囊壺菌的合成途徑可能不只有FAS途徑[41]。將裂殖壺菌與可產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的海洋希瓦氏細(xì)菌的基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其基因中存在編碼PKS 的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而提出裂殖壺菌合成DHA 的途徑類(lèi)似于海洋細(xì)菌中的PKS途徑，稱(chēng)為聚酮合酶途徑[42]。破囊壺菌通過(guò)PKS途徑合成DHA的過(guò)程如圖2所示。

PKS途徑中并沒(méi)有去飽和酶和延長(zhǎng)酶，是由乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A提供碳原子，先轉(zhuǎn)化為含有?；d體蛋白質(zhì)（ACP）的酯類(lèi)，并在縮合酶的作用下生成3-酮丁酰中間物。隨后在酮乙基還原酶、脫水酶和烯酰還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為丁酰-ACP。最后，丙二酰輔酶A 再次按上述方式連接到脂肪酰鏈上，每次增加2個(gè)碳原子，逐漸延長(zhǎng)碳鏈。PKS途徑是由一個(gè)類(lèi)似聚酮合成酶的基因簇控制，它包括β-酮酰合成酶、β-酮酰-ACP 還原酶、烯酰還原酶、脫水酶/異構(gòu)酶、?；D(zhuǎn)移酶和?；d體蛋白。在上述一系列酶的催化下，乙酰輔酶A 和丙二酸單酰輔酶A 作為基本單位，經(jīng)過(guò)縮合、還原、脫水、還原/異構(gòu)的循環(huán)合成DHA[34]。在破囊壺菌Thraustochytrid aureumATCC 34304 突變株中，F(xiàn)AS 途徑被阻斷，但其DHA 產(chǎn)量仍高于野生株[37]，由此表明PKS路徑的存在。

Li 等[43]從Schizochytriumsp.ATCC MYA1381 的PKS 基因簇中克隆了鏈長(zhǎng)因子（CLF）和脫氫酶（DH），并通過(guò)同源重組將其打亂導(dǎo)致PUFAs 生物合成顯著下降，其中CLF 的破壞降低了C22 PUFA的比例，而DH 的破壞則降低了各PUFA 的產(chǎn)量。李清[44]對(duì)Schizochytrium limacinumOUC168 的pks1（3908bp）和pks2（4272bp）基因成功克隆，其結(jié)果顯示pks1 可能屬于脫水/異構(gòu)酶（DH），pks2 可能包含兩個(gè)Ketoacyl-synthase 超家族，分別為Acyl transferase 超家族和TIM_phosphatebinding 超家族；周兵兵[45]通過(guò)對(duì)該菌株中的pks1基因過(guò)表達(dá)，將菌體的生物量和DHA 產(chǎn)量分別提高了14.6% 和37.9%。婁菲等[46]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)溫度降低時(shí)，Schizochytriumsp.S31 中PKS 相關(guān)基因（PFA1、PFA2 和PFA3）的表達(dá)量均有所上調(diào)，增加了PUFA 的含量。Ren 等[47]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明PKS 系統(tǒng)中的?；D(zhuǎn)移酶（AT） 基因的缺失導(dǎo)致了Schizochytriumsp. HX-308 的DHA 在總 脂 肪酸中的比例下降，而重組AT基因的導(dǎo)入使得DHA比例有所提高；此外，Ren 等[48]利用RNA-seq 技術(shù)對(duì)S.sp. HX-308 不同發(fā)酵階段的差異基因進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)PKS 途徑中的基因pfaC 對(duì)環(huán)境變化表現(xiàn)出較高的敏感性，可能是未來(lái)促進(jìn)多不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子。綜上所述，在破囊壺菌合成DHA 中，PKS 系統(tǒng)占有很重要的地位，提高PKS相關(guān)基因的表達(dá)量能夠提高其DHA產(chǎn)量。

圖2 破囊壺菌合成DHA的PKS通路

目前對(duì)于不同屬的破囊壺菌合成DHA 的具體機(jī)制尚未明確，對(duì)部分酶功能的認(rèn)識(shí)尚處于推測(cè)階段，并沒(méi)有進(jìn)行功能驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。此外，對(duì)兩條途徑之間的關(guān)系也并未研究清楚，兩條途徑之間是分工明確還是協(xié)調(diào)統(tǒng)一的關(guān)系尚待探究。以上一系列關(guān)于DHA 合成途徑的問(wèn)題迫切需要進(jìn)行深入研究，以豐富對(duì)脂肪酸合成路徑的認(rèn)識(shí)，為破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA 的代謝調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

3 影響破囊壺菌合成DHA的因素

微生物生產(chǎn)高附加值代謝產(chǎn)物不僅受到自身遺傳因素的影響，而且與外部營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件息息相關(guān)[49]。同樣，破囊壺菌DHA 的發(fā)酵生產(chǎn)也受許多環(huán)境因子的影響，包括碳氮源、溫度、溶解氧、pH、鹽度等。只有選擇最為合適的培養(yǎng)條件，才更有利于DHA 的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，因此發(fā)酵條件的優(yōu)化成為發(fā)酵生產(chǎn)中必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)[50]。表2總結(jié)了不同破囊壺菌菌株在搖瓶培養(yǎng)條件下生產(chǎn)DHA 的最佳碳氮源條件。下文對(duì)影響破囊壺菌DHA 累積的3 個(gè)關(guān)鍵因素（碳氮源、溫度和溶解氧）進(jìn)行綜述。

3.1 碳、氮源

微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基本單位是碳架。碳、氮源是微生物生長(zhǎng)、增殖和代謝的基本原料。破囊壺菌屬于異養(yǎng)型原生生物，在其發(fā)酵過(guò)程中必須添加適量的碳源和氮源，才能有足夠的物質(zhì)和能量維持自身的繁殖和代謝。碳、氮源的種類(lèi)和濃度，對(duì)破囊壺菌的生長(zhǎng)繁殖速度、脂質(zhì)累積速度和DHA 合成速度均有很重要的影響。

破囊壺菌常用的碳源包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和可溶性淀粉等[59]。不同菌株的最適宜的碳源種類(lèi)不同，本文作者課題組之前對(duì)兩株破囊壺菌T.sp.PKU#Mn16和Schizochytrium.sp.PKU#Mn4 進(jìn)行最優(yōu)碳源的考察，發(fā)現(xiàn)使用不同碳源培養(yǎng)，生物量的差異并不明顯，但其油脂和DHA產(chǎn)量卻具有顯著影響，其中甘油是最有利于油脂和DHA積累的碳源。與葡萄糖相比，在甘油為碳源的條件下兩株菌的DHA占總油脂的比例分別增加了16.2%和12.77%[21]。同樣地，在甘油為碳源的條件下，Schizochytrium limacinumSR21的DHA相對(duì)含量（DHA占總脂肪酸的比例）高達(dá)72.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了以葡萄糖為碳源的比例（30%～48%），由此表明甘油更有利于破囊壺菌中DHA的積累[18]。裂殖壺菌S.sp.S31和Thraustochytrium roseumMF2以葡萄糖為碳源時(shí)，生物量、脂質(zhì)含量以及DHA 產(chǎn)量均較高；而以乳糖、蔗糖等為碳源時(shí)，生物量和DHA產(chǎn)量均遠(yuǎn)低于前者[53-54]。因此，碳源對(duì)破囊壺菌的生長(zhǎng)、脂肪酸和DHA 累積均有明顯影響。葡萄糖和甘油是破囊壺菌可利用的優(yōu)質(zhì)碳源，同時(shí)與葡萄糖相比甘油更有利于破囊壺菌油脂的積累，而葡萄糖則對(duì)生物量的貢獻(xiàn)更大。

表2 破囊壺菌在搖瓶發(fā)酵的最佳碳氮源培養(yǎng)條件、生物量和DHA產(chǎn)量

破囊壺菌常用的氮源包括酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、谷氨酸鈉、玉米漿、尿素等有機(jī)氮源以及硫酸銨、乙酸銨、硝酸銨等無(wú)機(jī)氮源。不同氮源對(duì)不同破囊壺菌菌株的生長(zhǎng)和油脂積累的影響具有很大差異。在無(wú)機(jī)氮源硝酸鈉條件下，裂殖壺菌S.sp.S31 的生物量達(dá)到最大值（7.46g/L）；當(dāng)以尿素為氮源時(shí)，其油脂占生物量的比例達(dá)到最大值（43.39%）；以硝酸鈉作氮源，其油脂積累量達(dá)到最大值（2.4g/L）；使用酵母粉作氮源則可獲得最高 的 DHA 產(chǎn) 量 （0.31g/L）[54]。 破 囊 壺 菌Thraustochytriumsp. T01 利用酵母粉和蛋白胨作為混合氮源時(shí)，可以獲得較高的生物量（27g/L），與無(wú)機(jī)氮源（尿素、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉和硝酸鉀）相比其生物量為原來(lái)的4～7倍[57]。吳克剛等[53]對(duì)T.roseumMF2生產(chǎn)DHA的氮源利用進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最優(yōu)氮源為谷氨酸鈉；氮源種類(lèi)對(duì)其生物量、脂質(zhì)含量以及DHA 產(chǎn)量均有明顯影響，但是對(duì)DHA 相對(duì)含量并沒(méi)有顯著性影響，基本在60%左右。本文作者課題組[21]在前期對(duì)破囊壺菌T.sp.PKU#Mn16和S.sp.PKU#Mn4研究中發(fā)現(xiàn)，使用酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨和谷氨酸鈉等有機(jī)氮源，其細(xì)胞生長(zhǎng)以及油脂積累均優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源條件；在酵母粉條件下，DHA 產(chǎn)量最高分別達(dá)到1.16g/L 和0.82g/L。因此，不同的氮源種類(lèi)對(duì)破囊壺菌的生長(zhǎng)影響不盡相同；與無(wú)機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源尤其是酵母粉等，更有利于破囊壺菌的生長(zhǎng)和DHA累積。

針對(duì)碳氮源的研究，除了選擇適當(dāng)?shù)奶嫉捶N類(lèi)外，碳氮源的濃度以及合適的碳氮比（C/N）也是影響破囊壺菌細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的重要因素[60]。在較低濃度范圍內(nèi)，隨著碳源濃度的升高，破囊壺菌的生長(zhǎng)速度加快；當(dāng)碳源濃度增加到一定量時(shí)，其生長(zhǎng)速度會(huì)減緩甚至生長(zhǎng)受到抑制。氮源濃度的升高能夠促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但不利于油脂以及DHA的積累，培養(yǎng)基中碳源主要用于細(xì)胞生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基中氮源消耗至一定量時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始使用培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行油脂積累[49,61]。當(dāng)分別以葡萄糖和谷氨酸鈉為碳源和氮源（碳氮比為70）時(shí)，T. roseumMF2 的DHA 積 累 量 達(dá) 到 最 高1.242g/L。 對(duì)Aurantiochytriumsp. T66 進(jìn)行限氮培養(yǎng)后，其細(xì)胞中DHA 含量提升了一倍左右[62]。高碳氮比有利于破囊壺菌油脂積累量增大，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)適當(dāng)提高培養(yǎng)基中的碳氮比，使破囊壺菌生產(chǎn)DHA 達(dá)到最優(yōu)的條件。

總之，不同破囊壺菌菌株對(duì)碳源和氮源的選擇性不同，因此在實(shí)際操作中應(yīng)當(dāng)針對(duì)不同菌株使用不同的培養(yǎng)基成分及配比。葡萄糖和甘油是最常用的碳源，但是兩者對(duì)生物量和油脂的貢獻(xiàn)則各有不同，氮源促進(jìn)細(xì)胞分裂，但是在氮源存在的前提下其油脂積累較少，因此在后續(xù)發(fā)酵中可考慮使用混合碳源進(jìn)行發(fā)酵，并適當(dāng)提高碳氮比以提升DHA的產(chǎn)量。同時(shí)，在生產(chǎn)中應(yīng)適當(dāng)考慮實(shí)際效益情況，盡量選擇來(lái)源廣、易獲取、價(jià)格低的原料進(jìn)行生產(chǎn)，盡量降低生產(chǎn)成本，以獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益。

3.2 溶解氧

破囊壺菌作為一類(lèi)異養(yǎng)需氧微生物，主要通過(guò)有氧呼吸，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化成二氧化碳和水，并合成大量的能量來(lái)維持細(xì)胞的生命活動(dòng)。整個(gè)過(guò)程是經(jīng)過(guò)氧化呼吸鏈才能得以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)氧氣是呼吸鏈的終端電子受體，因此發(fā)酵液中必須有適當(dāng)濃度的溶解氧才能維持菌體的正常生理過(guò)程[63]。

關(guān)于破囊壺菌合成DHA 的途徑一般認(rèn)為有兩條：一是需氧的傳統(tǒng)脂肪酸合成途徑（FAS），另一條是不依賴(lài)于氧的聚酮合酶途徑（PKS）[23]，下文會(huì)詳細(xì)介紹兩條DHA合成途徑。在FAS路徑中，破囊壺菌合成DHA 需氧參與碳鏈的延長(zhǎng)以及去飽和的過(guò)程，溶解氧的多少能夠直接影響菌體內(nèi)DHA 的累積。而在PKS 路徑中，雖然DHA 由聚酮合酶催化、乙酰輔酶A 作為碳鏈骨架而最終合成，不需要氧氣的參與；但是溶解氧影響著菌體的整個(gè)生命過(guò)程，如不提供氧氣，菌體的生長(zhǎng)便會(huì)受到抑制，繼而影響DHA 的產(chǎn)量[42]。由于破囊壺菌體內(nèi)FAS與PKS兩條通路同時(shí)存在，而溶解氧對(duì)兩條通路均有影響，因此溶解氧作為一個(gè)非常重要的發(fā)酵參數(shù)受到廣泛關(guān)注。

一般在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，采用兩階段培養(yǎng)法，在高溶氧條件下使菌體大量增殖，然后降低溶氧促進(jìn)DHA 的積累。對(duì)S.sp.HX-308 進(jìn)行兩階段培養(yǎng)，通過(guò)改變發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速或通氣量以降低溶氧水平，其油脂和DHA 積累量分別提升了43.83%和63.88%[64]。而對(duì)于S.limacinumSR21，在高溶氧條件下，細(xì)胞大量增殖，但細(xì)胞大小和質(zhì)量變化不明顯；在低溶氧條件下，細(xì)胞體積變大，油脂積累；對(duì)其進(jìn)行分階段溶氧控制培養(yǎng)，使得生物量與對(duì)照組提高了54%左右，最高可達(dá)37.9g/L，而DHA 產(chǎn)量也達(dá)到6.56g/L[65]。因此，在今后的破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)破囊壺菌的不同生長(zhǎng)階段改變其供氧量，最終達(dá)到高產(chǎn)DHA的目的。

3.3 溫度

溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)和油脂累積具有重要影響[66]。嗜熱微生物菌體所包含不飽和脂肪酸的量極少，而嗜冷微生物菌體內(nèi)則含有較多的不飽和脂肪酸[67]。一般而言，在一定溫度范圍內(nèi)，菌體生物量隨溫度升高而增加并達(dá)到峰值；但其油脂中不飽和脂肪酸的比例則隨溫度升高而降低，其可能是低溫能夠激活趨飽和酶基因的表達(dá)，菌體通過(guò)增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量來(lái)提高其流動(dòng)性，以此抵抗外界低溫環(huán)境的影響[68]。

不同的破囊壺菌菌株的生長(zhǎng)和代謝的最適溫度有所差異。通常情況下，破囊壺菌的最適生長(zhǎng)溫度為15～35℃，在最適溫度范圍內(nèi)其生物量能夠達(dá)到最高值，但其油脂以及DHA的積累量不一定達(dá)到最大；低溫脅迫可以提高DHA 的產(chǎn)量[69]。在25℃時(shí)，S. limacinumSR21 生物量達(dá)到最大值（42.45g/L）；當(dāng)溫度降低至20℃時(shí)，其多不飽和脂肪酸含量有所增加，DHA占總油脂比例由34%提高到了37.05%，而DHA 產(chǎn)量也由8.4g/L 提高到了9.8g/L[70]；裂殖壺菌S.sp.HX-308在30℃培養(yǎng)32h后，降低其培養(yǎng)溫度對(duì)其進(jìn)行溫度脅迫，最終DHA 占總油脂的比例可達(dá)51.98%，與之前相比提高了42%[71]。因此，在破囊壺菌工業(yè)化生產(chǎn)DHA 中應(yīng)考慮采取兩步發(fā)酵法，首先在較適宜的發(fā)酵溫度下獲得充足的生物量，再對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫以增加DHA 含量，最終達(dá)到DHA高產(chǎn)的目的。

綜合上述影響因子，將破囊壺菌生產(chǎn)DHA 的整個(gè)過(guò)程分為兩個(gè)階段：第一階段是菌體生長(zhǎng)時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期內(nèi)細(xì)胞密度快速增加，而細(xì)胞內(nèi)DHA 積累較少；第二階段是DHA 合成階段，在這個(gè)階段菌體細(xì)胞數(shù)量變化不大，然而細(xì)胞內(nèi)的DHA大量積累[15]。通常情況下，在第一階段，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及初級(jí)代謝產(chǎn)物，因此需要較高濃度的碳源和氮源、較適宜的生長(zhǎng)溫度以及較高的溶氧條件。而在氮源消耗至較低濃度時(shí)，菌體開(kāi)始積累DHA 等次級(jí)代謝產(chǎn)物，在這個(gè)階段應(yīng)考慮補(bǔ)加碳源，促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[72]。如表3所示為分階段培養(yǎng)法在破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA 中的應(yīng)用，可以明顯看出與單一條件培養(yǎng)相比，在分階段培養(yǎng)條件下其DHA 產(chǎn)量有大幅度提升。因此，在實(shí)際的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)在發(fā)酵的初始階段一次性補(bǔ)加足夠的氮源，添加最適破囊壺菌菌體生長(zhǎng)的碳源，適當(dāng)提高溫度以及供氧量來(lái)促進(jìn)菌體的快速增長(zhǎng)；至氮源消耗盡時(shí)，進(jìn)入第二階段，此時(shí)補(bǔ)加碳源，降低溫度以及供氧量進(jìn)行限氮、低氧、低溫脅迫，促進(jìn)菌體中DHA 的合成以達(dá)到高產(chǎn)的目的。

4 破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA 的中試研究

微生物發(fā)酵中試試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，模擬工業(yè)化條件所進(jìn)行的工藝研究，其目的是驗(yàn)證放大后小試工藝的可行性，以及菌株是否具有可放大、可工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，從而為正式生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)。中試放大是微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)到產(chǎn)品生產(chǎn)不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)，有利于降低產(chǎn)業(yè)化的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也能夠在一定程度上使研發(fā)、生產(chǎn)成本有所降低[77]。利用破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA 的中試研究目前尚處于起步階段，由于在放大過(guò)程中不可能保持所有物理或化學(xué)參數(shù)不變，因此必須對(duì)影響中試發(fā)酵的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究，進(jìn)而更好地為產(chǎn)業(yè)化服務(wù)。

對(duì)于對(duì)剪切力不敏感的微生物而言，在好氧發(fā)酵過(guò)程中，體積傳氧系數(shù)（KLa）通常是最重要的影響因素，因此KLa是好氧發(fā)酵中最常見(jiàn)的中試放大準(zhǔn)則之一[78]。以KLa為放大準(zhǔn)則是通過(guò)在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中保持KLa、攪拌功率、幾何形狀、容積功率輸入等相關(guān)變量的相似性，逐步擴(kuò)大到較大的發(fā)酵罐中，進(jìn)而擴(kuò)大其培養(yǎng)規(guī)模[77]。Qu等[79]基于KLa成功地將S.sp. CCTCC M209059 發(fā)酵規(guī)模擴(kuò)大至7000L，最終，其DCW 產(chǎn)量達(dá)到92.7g/L，DHA濃度達(dá)17.7g/L。在以KLa為準(zhǔn)則進(jìn)行放大時(shí)，同樣應(yīng)考慮到發(fā)酵液流體力學(xué)、機(jī)械剪切力等相關(guān)的作用。Zhao等[80]研究了15L發(fā)酵罐中不同的葉輪結(jié)構(gòu)對(duì)S.sp.HX-308 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)以及DHA 合成的影響，發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型葉輪組合能夠顯著提高裂殖壺菌生物量及DHA產(chǎn)量，生物量最高可達(dá)108g/L，DHA 產(chǎn)量最高可達(dá)21.42g/L，占總油脂的48.17%。Guo 等[15]基于葉輪對(duì)發(fā)酵液流動(dòng)性的影響設(shè)計(jì)了6種不同的葉輪，在7000L的發(fā)酵罐中成功放大并應(yīng)用，最終其生物量達(dá)到128.3g/L，而DHA產(chǎn)量達(dá)39.2g/L。因此，在中試放大過(guò)程中，除考慮體積傳氧系數(shù)（KLa）外，還應(yīng)考慮計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)和生物生理特性分析等諸多方面，才能更進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[81]。

表3 分階段培養(yǎng)法在破囊壺菌生產(chǎn)DHA中的應(yīng)用

目前在破囊壺菌中試放大試驗(yàn)中，由于放大前后不能同時(shí)保持所有參數(shù)一致，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐中細(xì)胞培養(yǎng)條件和生理狀態(tài)存在顯著差異[82]。此外，培養(yǎng)規(guī)模的變化會(huì)影響發(fā)酵罐環(huán)境的同質(zhì)性，從而導(dǎo)致發(fā)酵參數(shù)（溶解氧、底物濃度、pH 等）在空間上的分布不均，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)在不均勻的環(huán)境中并在不同區(qū)域之間穿梭時(shí)，這些波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致它們的遺傳、轉(zhuǎn)錄和代謝水平的變化，進(jìn)而影響目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[83-84]?，F(xiàn)有的中試放大技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌發(fā)酵既低能耗又高效、高產(chǎn)且可獲得高含量DHA 的目標(biāo)，因此后續(xù)對(duì)破囊壺菌進(jìn)行中試放大研究仍然是工業(yè)化生產(chǎn)的一大重點(diǎn)。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)DHA 的需求量不斷增加，采用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA 具有廣闊的市場(chǎng)前景。為了提高破囊壺菌的DHA 產(chǎn)量，傳統(tǒng)的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，發(fā)酵工藝流程改進(jìn)等方面?，F(xiàn)階段，更多的研究者從DHA 合成路徑入手，通過(guò)對(duì)多不飽和脂肪酸合成路徑中的基因及相關(guān)酶的研究，調(diào)控其關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，最終運(yùn)用基因工程手段提高DHA 的產(chǎn)量[85]。隨著當(dāng)前對(duì)破囊壺菌的基因改造及代謝途徑研究取得的初步進(jìn)展，利用破囊壺菌大規(guī)?；a(chǎn)DHA仍有很大的進(jìn)步空間。

目前，在破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA 方面主要存在以下幾方面的問(wèn)題：優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源少，細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累不穩(wěn)定以及細(xì)胞代謝通路不清晰、難以調(diào)控，中試放大關(guān)鍵因素難以確定等。因此，今后關(guān)于破囊壺菌的研究工作應(yīng)圍繞高產(chǎn)DHA 的破囊壺菌菌株的篩選，對(duì)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境條件的深入研究，對(duì)多不飽和脂肪酸合成通路及菌體代謝調(diào)控的研究，DHA 發(fā)酵工藝的放大等方面。以此為實(shí)現(xiàn)破囊壺菌生產(chǎn)DHA的工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，從而推動(dòng)DHA 在醫(yī)藥、食品、保健品、飼料等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用。