抗氧化劑對賴氨酸-葡萄糖反應生成羧甲基賴氨酸的抑制研究*

豆康寧，華向美，黃亞男，李盤欣，韓文鳳，石 曉，王 飛

（1.漯河醫(yī)學高等?？茖W校河南省休閑食品工程技術研究中心，河南 漯河 462002；2.漯河出入境檢驗檢疫局，河南 漯河 462002；3.河南南街村（集團）有限公司，河南 漯河 462600；4.漯河職業(yè)技術學院，河南 漯河 462002）

食品中 Nε-(1-羧甲基)-L-賴氨酸（Nε-(1-Carboxyethyl)-L-Lysine）簡稱羧甲基賴氨酸或CML，是晚期糖基化終末產(chǎn)物中最主要代表之一[1]，對人體健康具有一定危害，如能促進人體器官的衰老，腎病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展[2]。羧甲基賴氨酸普遍存在于食品中，如烘焙食品、方便面、醬油等[3]。因此，研究抑制羧甲基賴氨酸的生成，對提高食品的質量與安全具有重要價值。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑對食品中羧甲基賴氨酸的生成具有抑制作用[4]，該文研究了具有抗氧化性的抑制劑維生素B1、維生素B6、兒茶素、白藜蘆醇、丁基羥基茴香醚（BHA）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）對賴氨酸-葡萄糖生成羧甲基賴氨酸的抑制作用，為食品中羧甲基賴氨酸的控制提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羧甲基賴氨酸(CML)標準品：色譜純，加拿大TRC公司；甲醇、甲酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；水:一級純水；維生素B1、維生素B6、兒茶素、白藜蘆醇、BHA、TBHQ：含量 98%，南京納滿生物科技有限公司；葡萄糖、L-賴氨酸，色譜純，sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸鈉、硼氫化鈉以及三氟乙酸，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters-XevoTQ型液相色譜串聯(lián)質譜儀、Waters ACQUITY UPLC-BEH Amide型色譜柱，美國Waters公司；YP3001N型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；DKU-3型油浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；SPE固相萃取小柱，沃特世科技(上海)有限公司，LGJ-18B型冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術有限公司。

2 試驗方法

2.1 賴氨酸-葡萄糖美拉德模擬反應及抑制體系的建立

用50 mmol/L，pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.3 mol/L的賴氨酸-葡萄糖的反應液，然后按照質量百分比添加1%、2%、5%、10%、20%的維生素B1、維生素B6、兒茶素、白藜蘆醇、丁基羥基茴香醚、叔丁基對苯二酚，在100℃油浴條件下加熱20 min后取出各反應管，冷卻后備用。

2.2 羧甲基賴氨酸檢測樣品前處理

參考Jialiang等[5]以及 Maria等[6]報道的方法，對2.1反應所得的樣品進行處理，得HPLC-MS檢測樣品。具體步驟參考文獻[7]中LC-MS/MS法測定CML及CEL含量。

2.3 HPLC-MS檢測條件

流動相：0.1%甲酸:甲醇=7:3，流動相流速為0.5 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為10 μL，運行時間為10 min。質譜條件：離子源溫度為100℃，脫溶劑溫度為300℃，錐孔電壓為20 eV，錐孔氣體流速為50 L/h，脫溶劑氣體流速為350 L/h，載氣為氮氣。選擇性離子監(jiān)測（SIR）：羧甲基賴氨酸準分子離子質荷比m/z 205，離子碎片質荷為m/z 130和m/z 84。

2.4 羧甲基賴氨酸標準曲線測定方法

分別制備濃度為 5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的羧甲基賴氨酸溶液，然后測定響應值，建立羧甲基賴氨酸濃度與響應值之間的關系曲線。

2.5 添加劑對羧甲基賴氨酸抑制率的計算

賴氨酸-葡萄糖模擬體系中羧甲基賴氨酸含量的計算公式如下：

X為抑制率；CML為羧甲基賴氨酸。

2.6 數(shù)據(jù)分析

以上所有實驗方法中涉及的實驗數(shù)據(jù)均做平行試驗2次，使用SPSS 18.0數(shù)理統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。

3 實驗結果

3.1 羧甲基賴氨酸標準曲線

濃度為 5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的羧甲基賴氨酸溶液的液質色譜響應值R分 別 為 5 153.81、1 010 168.38、18 670.31、37853.33、73 945.83，所建立的曲線方程為 Y=916.97X+732.36，相關系數(shù) R=0.9998。

圖1為羧甲基賴氨酸標準品液質色譜出峰圖，出峰時間范圍為4.67～4.69 min。圖2為羧甲基賴氨酸特征離子峰，羧甲基賴氨酸的特征離子質荷比為205、130、84。圖3為賴氨酸-葡萄糖模擬體系液質色譜出峰圖。

圖1 羧甲基賴氨酸標準品液質色譜出峰圖

圖2 羧甲基賴氨酸的質譜特征離子峰

圖3 賴氨酸-葡萄糖反應產(chǎn)物液質色譜出峰圖

3.2 維生素類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

在賴氨酸-葡萄糖的反應液中，按照質量百分比分別添加 1%、2%、5%、10%、20%的維生素 B1、維生素B6，維生素B1、維生素B6對羧甲基賴氨酸的抑制率見圖4所示。

圖4 維生素類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

從圖4可知，隨著維生素B1、維生素B6添加量的增加，羧甲基賴氨酸的抑制率逐漸增加，當添加量為20%時，維生素B1的抑制率為21.46%，維生素B6的抑制率為9.37%，維生素B1的抑制效果比維生素B6效果好。劉薈萃[8]研究了維生素B1對油炸麻花中羧甲基賴氨酸具有抑制作用。維生素B1抑制羧甲基賴氨酸的機理，作用方式是通過清除美拉德反應生成的活性羰基化合物，進而抑制了羧甲基賴氨酸的形成[9-10]。

3.3 多酚類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

在賴氨酸-葡萄糖的反應液中，按照質量百分比分別添加1%、2%、5%、10%、20%的兒茶素、白藜蘆醇，兒茶素、白藜蘆醇對羧甲基賴氨酸的抑制率見圖5所示。

圖5 多酚類添加劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

從圖5可知，隨著兒茶素、白藜蘆醇添加量的增加，羧甲基賴氨酸的抑制率逐漸增加，當添加量為20%時，兒茶素的抑制率為10.95%，白藜蘆醇的抑制率為13.68%，白藜蘆醇的抑制效果比兒茶素抑制效果好。劉慧琳等[11]研究了6種多酚類物質對羧甲基賴氨酸的抑制研究，結果顯示白藜蘆醇的抑制作用最大。周燕瓊[12]研究發(fā)現(xiàn)兒茶素對曲奇餅干中羧甲基賴氨酸的生成具有良好的抑制作用。Rice-E-vans等[13]研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物通過抑制葡萄糖的自氧化反應和清除自由基等方式抑制羧甲基賴氨酸的形成。兒茶素、白藜蘆醇為多酚類抗氧化劑，具有抑制羧甲基賴氨酸生成作用。

3.4 化學合成抗氧化劑對羧甲基賴氨酸的抑制

在賴氨酸-葡萄糖的反應液中，按照質量百分比分別添加 1%、2%、5%、10%、20%的 BHA、TBHQ，BHA、TBHQ對羧甲基賴氨酸的抑制率見圖6所示。

圖6 化學合成抗氧化劑對羧甲基賴氨酸的抑制率

從圖6可知，BHA、TBHQ對羧甲基賴氨酸的生成具有促進作用，也即抑制率為負值，抑制率越小，促進作用越大。隨著BHA、TBHQ添加量的增加，羧甲基賴氨酸的抑制率逐漸減小，當BHA、TBHQ添加量為20%時，BHA的抑制率為-2.49%，TBHQ的抑制率為-42.13%。這說明BHA對羧甲基賴氨酸的促進作用較小，而TBHQ對羧甲基賴氨酸的促進作用較大。付如意[14]研究發(fā)現(xiàn)，在食品模擬體系中，具有抗氧化性的維生素C、維生素E對羧甲基賴氨酸無抑制效果。劉紅[15]研究了4種抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ、Vc對多種美拉德模擬體系反應的影響，4種抗氧化劑對甘氨酸-葡萄糖體系有顯著影響，對天冬酰胺-葡萄糖體系無顯著影響。因此，有的抗氧化劑具有抑制羧甲基賴氨酸的生成作用，而有的卻沒有，有的甚至還具有促進生成作用。

4 結論

維生素類抗氧化劑維生素B1、維生素B6和多酚類抗氧化劑兒茶素、白藜蘆醇對賴氨酸-葡萄糖生成羧甲基賴氨酸具有抑制作用，抑制率從大到小的順序依次為維生素B1、白藜蘆醇、兒茶素、維生素B6；化學合成抗氧化劑BHA、TBHQ對賴氨酸-葡萄糖生成羧甲基賴氨酸具有促進作用，BHA促進作用較小、TBHQ促進作用較大。有的抗氧化劑具有抑制羧甲基賴氨酸的生成作用，而有的卻沒有，有的甚至還具有促進生成作用，其原因有待進一步探明。