基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究中藥川芎治療高血壓的藥理作用機(jī)制

晏相如 丁雨點(diǎn) 李順利 楊豆豆 何緒華 蔣文雯

貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025

近10年來(lái)，隨著現(xiàn)代基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等“組學(xué)”理論的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)視角的引入以及生物信息學(xué)的應(yīng)用,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) (Network Pharmacology) 概念應(yīng)運(yùn)而生[1-2], 它是在系統(tǒng)生物學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的, 基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上, 通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析, 系統(tǒng)綜合地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響, 揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘[3]。這與中醫(yī)學(xué)從整體的角度去診治疾病的理論, 中藥及其復(fù)方的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸, 無(wú)疑為跨越中西醫(yī)間的鴻溝架起了橋梁, 為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化指明了方向。

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛的作用[4]。川芎主要含有揮發(fā)油、生物堿、有機(jī)酸等化學(xué)成分，有治療高血壓、抗血栓形成、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤等藥理作用[5-7],其在臨床上可用于治療心血管疾病、眩暈癥、腎臟疾病等[8-9]。高血壓是危害人類(lèi)健康的疾病之一，隨著社會(huì)的發(fā)展，無(wú)論是老人或是小孩都有患高血壓的幾率，且患病的人數(shù)在逐漸增加[10]。課題組推測(cè)活血化瘀中藥川芎或許能“擾動(dòng)/抑制”高血壓相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)而對(duì)高血壓產(chǎn)生一定的治療效果，但其成分、靶點(diǎn)與作用機(jī)制等尚不明確。本研究依靠網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川芎降血壓的作用靶點(diǎn)與可能的作用機(jī)制，為其抗高血壓的研究和臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 川芎有效成分的篩選 川芎具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同的作用，本研究采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行川芎有效成分篩選，該數(shù)據(jù)庫(kù)包括中國(guó)藥典注冊(cè)的499種中藥，含29 384種成分，3 311個(gè)靶標(biāo)和837個(gè)相關(guān)疾病，其特別的價(jià)值在于，它為每種化合物提供了藥物藥代動(dòng)力學(xué)信息，如成藥相似性(DL)，口服生物利用度(OB)，血腦屏障(BBB)，腸上皮通透性(Caco-2)等參數(shù)。一般類(lèi)藥性DL>0.18 、口服利用度OB>30%的分子具有較好的成藥可能，本研究根據(jù)中藥川芎的特性，設(shè)置DL>0.18, OB>30%，篩選其有效成分。

1.2 成分-靶點(diǎn)篩選 接下來(lái)通過(guò)已知的成分化合物，去尋找其可能作用的靶點(diǎn)。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)采用的是 HIT數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)算法SysDT 來(lái)獲得藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)系。本研究首先利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到預(yù)測(cè)的分子靶點(diǎn)，同時(shí)保存分子的mol2結(jié)構(gòu)文件；在Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)里輸入分子名得到預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)，并保存分子3D結(jié)構(gòu)的sdf格式；pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用潛在作用靶點(diǎn)反向預(yù)測(cè)，進(jìn)行藥效因匹配預(yù)測(cè)靶點(diǎn)并打分，Z’-score越大說(shuō)明可能性越大，輸入分子3D結(jié)構(gòu)，提交并進(jìn)行篩選得到分子的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)收集 使用高血壓“hypertension”為關(guān)鍵詞在GeneCards(http://genecards.org)、CTD(http://ctdbase.org)、TTD(https://db.idblab.org/ttd)、OMIM(http://omim.org)數(shù)據(jù)庫(kù)力查找疾病靶點(diǎn)。

1.4 有效成分-疾病靶點(diǎn) 將上述所得成分的作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入cytoscape進(jìn)行merge分析，得成分-疾病交集靶點(diǎn)。Cytoscape 軟件源自美國(guó)系統(tǒng)生物學(xué)研究所，用于將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)與高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合在一起，其網(wǎng)絡(luò)圖包括節(jié)點(diǎn)(node)和邊(edge)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)可以是基因、miNRA或蛋白質(zhì)等，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接 (edge) 代表著這些節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 研究蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘核心的調(diào)控基因。String是一個(gè)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、從PubMed摘要中文本挖掘的結(jié)果和綜合其他數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)等方法來(lái)研究蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)。將得到的交集基因輸入String中，以獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因通路構(gòu)建 將所得靶基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇P值小于0.05，進(jìn)一步運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)所涉及的基因功能Gene-Ontology (GO) 進(jìn)行注釋分析，并對(duì)相關(guān)通路(Pathway)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 主要成分信息 設(shè)置DL>0.18，篩選出川芎有效成分20個(gè)，再經(jīng)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)阿魏酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯是治療心血管疾病的有效成分，因此通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和文獻(xiàn)查閱共得川芎有效成分23個(gè)?；拘畔⒁?jiàn)表1。

表1 川芎有效成分

2.2 成分-靶點(diǎn)篩選與疾病基因收集 使用TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)川芎有效成分潛在的作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選收集，然后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將檢索到的所有靶點(diǎn)蛋白校正為其官方名稱(chēng)(Officical Symbol)。共得到20個(gè)有效成分共167個(gè)作用靶點(diǎn)，其中3個(gè)成分沒(méi)有有效靶點(diǎn)。使用高血壓“hypertension”為關(guān)鍵詞在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，并將靶點(diǎn)名使用uniprot統(tǒng)一為基因名，共得到484個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3 有效成分-疾病靶點(diǎn) 將以上所得成分的167個(gè)作用靶點(diǎn)與疾病484個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入cytoscape進(jìn)行merge分析，得到41個(gè)交集靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 川芎治療高血壓的有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)分析 PPI網(wǎng)絡(luò)所得結(jié)果如圖2所示，將與高血壓有關(guān)的41個(gè)靶蛋白進(jìn)行PPI互作分析，得到最主要的靶蛋白，其中degree=22的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)；degree=20的轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)；degree=19的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2);degree=18的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)；degree=17的原癌基因c-Fos(FOS)；degree=15的低氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1A)；degree=14的血紅素加氧酶1(HMOX1)、雄激素受體(AR)；degree=12的凝血酶原(F2)、細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4)等節(jié)點(diǎn)度值大，在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，提示川芎可通過(guò)調(diào)節(jié)以上生長(zhǎng)因子、受體、酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、激活因子、轉(zhuǎn)錄因子、誘導(dǎo)因子類(lèi)關(guān)鍵靶蛋白，發(fā)揮治療高血壓的作用。

2.5 基因通路結(jié)果 將所得41個(gè)靶基因?qū)隓avid數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇P值小于0.05，基因通路構(gòu)建所得GO結(jié)果見(jiàn)表2、KEGG結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 KEGG信號(hào)通路

2.6 GO生物過(guò)程分析 如表2所示，將川芎治療高血壓發(fā)揮作用的41個(gè)靶基因進(jìn)行GO生物過(guò)程富集，選擇P<0.05的與高血壓有關(guān)的GO生物過(guò)程，主要為：MAPK活性的正調(diào)控、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)、血管舒張的正調(diào)控、血壓的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)調(diào)控、血管生成的正調(diào)控、血管收縮的正向調(diào)節(jié)等。提示川芎可能通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路表達(dá)、阻斷血管收縮分子去氧腎上腺素等的生成、增加平滑肌細(xì)胞數(shù)量促進(jìn)血管舒張、減少鈣離子進(jìn)入細(xì)胞、促進(jìn)血管生成和正向調(diào)節(jié)血管收縮等生物過(guò)程治療高血壓疾病。

2.7 KEGG信號(hào)通路分析 將川芎的41個(gè)靶點(diǎn)基因在David進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，根據(jù)P<0.05篩選得到影響心血管類(lèi)疾病高血壓的相關(guān)信號(hào)通路15條，為了達(dá)到對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類(lèi)的目的，將篩選得到的通路用Omicshare數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG富集分析結(jié)果可視化，圖3所示。并將篩選所得通路與靶點(diǎn)用cytoscape作靶點(diǎn)-通路圖。分析篩選得到通路主要為：PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、抗胰島素通路、VEGF信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、多巴胺能神經(jīng)突觸、前列腺癌通路等。

圖3 川芎治療高血壓疾病的相關(guān)通路富集圖

3 討論

高血壓屬于心血管疾病的常見(jiàn)疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。川芎辛散溫通，功能活血祛瘀，作用廣泛，適用于各種瘀血阻滯之病癥。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)川芎治療高血壓的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，通過(guò)TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper、genecard、ctd等數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，并利用cytoscape軟件進(jìn)行靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相交繪制，發(fā)現(xiàn)川芎與VEGFA、HMOX1、PPARG、NOS3、FOS、PTGS2、JUN、HIF1A、STAT3、F2、CYP3A4、AR、EGFR、NR3C1等41個(gè)與高血壓相關(guān)的靶標(biāo)蛋白相互作用，隨后進(jìn)行PPI互作分析得到節(jié)點(diǎn)度較高的核心靶點(diǎn)：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)以及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和原癌基因c-Fos(FOS)。其中VEGFA在血管生成中起積極作用，誘導(dǎo)使血管通透性增加，VEGFA分泌水平升高會(huì)引起血管平滑肌(VSMCS)增殖水平的上升，參與高血壓誘導(dǎo)的血管重建。高血壓患者的微循環(huán)至大血管均有不同程度的血管內(nèi)皮受損發(fā)生， VEGFA具有促進(jìn)血管內(nèi)皮增生、新生血管生成以及增加血管通透性的功能，血管內(nèi)皮能夠接受血液中的激素水平、壓力水平、炎癥介質(zhì)等相關(guān)信號(hào)，這些信號(hào)的接受會(huì)使得血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌不同的生物活性物質(zhì)用以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，參與血管的收縮與舒張，進(jìn)而調(diào)節(jié)局部血管功能的完整性[11]，從而控制血壓。HMOX1在生理?xiàng)l件下活性最高的是脾臟，趙寧等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)HMOX1基因的rs59607267位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓及血壓水平相關(guān)。NOS3通過(guò)cGMP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與血管平滑肌舒張，產(chǎn)生的NO介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈血管生成，并通過(guò)激活血小板識(shí)別因子促進(jìn)凝血，高鵬等[13]的研究發(fā)現(xiàn)NOS3基因14號(hào)內(nèi)含子rs3918181多態(tài)性與高血壓的發(fā)生相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了該基因與高血壓發(fā)生的相關(guān)性。

通過(guò)KEGG通路分析，研究發(fā)現(xiàn)川芎主要通過(guò)HIF-1信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、雌激素、胰島素抵抗以及前列腺癌等通路的調(diào)控以治療高血壓疾病。

血管損傷是一個(gè)慢性、低度炎癥反應(yīng)的過(guò)程，它是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)及共同的病理學(xué)基礎(chǔ)[14]。有研究表明TNF-α即腫瘤壞死因子-α在原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，TNF-α不但參與機(jī)體的免疫防御功能，而且還是重要的炎癥促進(jìn)因子，可通過(guò)多種途徑促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣快速升高，引起血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致血壓升高[15]。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-2β兩個(gè)亞基構(gòu)成，HIF-1α 作為缺氧條件下的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)血管的生成及細(xì)胞的凋亡和自噬，并參與調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路。其中VEGF是受HIF-1直接調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可通過(guò)與其特異性受體VEGFR結(jié)合激活酪氨酸蛋白激酶活性，促進(jìn)新生血管的形成,提高血管通透性[16-17]。

PI3K/ Akt和其它一些下游通路可在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)高血壓癥中被激活[18]，PI3K/ Akt信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡增殖的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，通過(guò)激活A(yù)kt及其下游靶點(diǎn)p53等，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖、生存和抗凋亡，從而影響血管內(nèi)皮的細(xì)胞凋亡,此外雌激素涉及到P13K-Akt通路生成血管舒張因子NO、影響MAPK通路進(jìn)而調(diào)節(jié)血壓。

VEGF信號(hào)通路中VEGF因子是促血管新生作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子, 不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及血管結(jié)構(gòu)的形成，還能促進(jìn)血流和血管通透性的改變。高血壓導(dǎo)致心肌肥大，是心臟自身針對(duì)血流動(dòng)力學(xué)因素改變，通過(guò)自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)而發(fā)生的一種適應(yīng)性改變，有研究發(fā)現(xiàn)肥大的心肌細(xì)胞VEGF表達(dá)增強(qiáng)[19]。

鈣信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+通道，穩(wěn)定血壓，鈣可以使外周血管阻力增加，從而導(dǎo)致血壓升高，也有研究認(rèn)為鈣可以增加血管平滑肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，緩解精神緊張性血壓升高，降低血管內(nèi)源性加壓素的反應(yīng)，促進(jìn)尿鈉排泄，減少血容量，解除Na-K-ATP酶的活性抑制，增強(qiáng)鈉和鉀的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，舒張血管平滑肌，降低血壓[20]。

川芎除主要作用于上述通路以外，雌激素可降低血管通透性和血清膽固醇，松弛素作為胰島素超家族的多肽激素之一，具有血管生成和舒張血管的作用，催產(chǎn)素能減少人體內(nèi)腎上腺酮等壓力激素的水平，以降低血壓。

隨著科學(xué)研究的不斷深入，新的藥物靶點(diǎn)以及降壓藥不斷出現(xiàn)，使得高血壓疾病的治療得到更多的改善。此次研究結(jié)果初步闡釋了川芎治療高血壓的作用機(jī)制，為開(kāi)展探索川芎治療高血壓疾病相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及藥理作用機(jī)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。