甘草酸的增溶作用探究

薛禾菲 張琬靖 劉 沛 劉翠哲

承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000

藥物的水溶性一直以來是藥物制劑研發(fā)過程中重點關(guān)注的問題。藥物在水中的溶解度過低，在體內(nèi)的溶出速率慢，生物利用度低，不利于發(fā)揮治療作用。因此選擇適宜的方法來提高難溶性藥物的溶解度就顯得非常重要。文獻(xiàn)報道[1]三萜皂苷類成分具有表面活性劑的性質(zhì)，可起到増溶的作用。甘草酸是一種應(yīng)用廣泛的三萜皂苷類成分，具有保肝，抗炎，抗菌，抗病毒，調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[2-3]，是甘草的主要有效成分。有研究發(fā)現(xiàn)甘草酸具有增溶作用[4]。利用甘草酸的這一性質(zhì)，使之與水溶性較差的藥物配伍使用，可以使這些藥物的溶解度增加，讓藥物的療效得到更好的發(fā)揮。

本實驗選擇薯蕷皂苷元和齊墩果酸兩種藥物來探究甘草酸的增溶作用。薯蕷皂苷元，是一種天然的甾體皂苷。齊墩果酸，為五環(huán)三萜類化合物。兩種成分均分布于自然界多種植物中，來源廣泛，且均具有保肝，抗炎，抗菌，抗病毒，調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[5-6]。二者在水中的溶解度都很低，直接給藥，生物利用度較差。目前尚未見利用甘草酸提高薯蕷皂苷元和齊墩果酸溶解度的報道。本實驗考察不同濃度甘草酸對薯蕷皂苷元和齊墩果酸在水溶液中溶解度的影響，初步考察甘草酸的增溶作用。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 甘草酸原料藥(西安綠之茵生物科技有限公司,批號：20190325)，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號：19032704)，薯蕷皂苷元原料藥(南京春秋生物工程有限公司,批號：20170113)，薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號：16112803)，齊墩果酸原料藥(江西安邦藥業(yè)有限公司,批號：20160901)，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院,批號：110709-201607)均為分析純；甲醇(Fisher Technology Inc, USA)，乙腈(Fisher Technology Inc, USA)，甲酸(Fisher Technology Inc, USA)均為質(zhì)譜級；實驗用水為屈臣氏蒸餾水(屈臣氏股份有限公司)。

1.2 儀器 AB SCIEX QTRAP 5500 質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司)，Waters Acquity UPLC 液相色譜儀(美國Waters公司)，HZQ-C氣浴恒溫振蕩器(金壇市天竟實驗儀器廠)，AG-254電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元溶解度考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，精密稱定，于100 mL量瓶中，加入乙腈溶液充分溶解，搖勻，置于4℃冰箱保存。

2.1.2 測定條件的選擇 色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流動相：乙腈(0.03%體積分?jǐn)?shù)甲酸)：水(含0.03%體積分?jǐn)?shù)甲酸)= 85∶15；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；洗脫時間5 min。

質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；電壓：5.5 KV；離子源溫度500 ℃；氣簾氣：35 Psi；霧化氣(GS1)：50 Psi，輔助氣(GS2)：50Psi。離子對m/z 415.2→271.2；去簇電壓71.96 eV，碰撞電壓23.03 eV。

圖1 薯蕷皂苷元空白(a)和薯蕷皂苷元對照品(b)色譜圖

2.1.3 線性范圍考察 取薯蕷皂苷元對照品儲備液，用乙腈稀釋制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(5～500 ng/mL)，進(jìn)樣，測定峰面積。以薯蕷皂苷元對照品溶液的質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作直線回歸。回歸方程為y=32559x+146875(R2= 0.9997)。

2.1.4 精密度考察 取薯蕷皂苷元對照品儲備液，乙腈稀釋制備20、200、400 ng/mL不同濃度供試品溶液，進(jìn)樣，計算精密度。RSD分別為0.75%，0.81%和0.69%(n=6)。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.1.5 回收率考察 在含有0.05 mmol/L的甘草酸溶液中，加入薯蕷皂苷元對照品溶液，配制成為質(zhì)量濃度為50 ng/mL的溶液，過濾，進(jìn)樣，用外標(biāo)法計算。所測薯蕷皂苷元回收率為101.8%，RSD=0.35%(n=6)，符合測定要求。

2.1.6 樣品的制備與處理 取一定量甘草酸加入90℃蒸餾水配制為甘草酸水溶液，外標(biāo)法確定甘草酸含量，制備得到1 mmol/L甘草酸溶液，依次稀釋得到1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0 mmol/L濃度甘草酸水溶液各10 mL。每種溶液分三份，每份3 mL，分別加入過量的薯蕷皂苷元，于37 ℃恒溫氣浴振蕩器中振蕩48 h，使溶解達(dá)到平衡。取樣，用0.2 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液用乙腈稀釋五倍。取1 mL進(jìn)樣測定。

2.1.7 甘草酸對薯蕷皂苷元增溶作用 甘草酸溶液濃度的變化對薯蕷皂苷元溶解度的影響如圖2所示，在不加入甘草酸時，薯蕷皂苷元在水中的溶解度僅為6.15 ng/mL。在加入甘草酸后，薯蕷皂苷元的溶解度隨甘草酸溶液濃度的升高而增加，當(dāng)甘草酸溶液的濃度達(dá)到1 mmol/L時，薯蕷皂苷元的溶解度為360.59 ng/mL，比薯蕷皂苷元在水中的溶解度增加約60倍。

圖2 不同濃度甘草酸溶液對薯蕷皂苷元溶解度的影響

2.2 齊墩果酸溶解度考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 測定條件的選擇 色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流動相：甲醇(含0.03%體積分?jǐn)?shù)甲酸)：水(含0.03%體積分?jǐn)?shù)甲酸)=85∶15；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；洗脫時間5 min。

質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，負(fù)離子模式檢測，離子噴霧電壓-4500 V；電壓：5.5 KV；離子源溫度500 ℃；氣簾氣：20 Psi；霧化氣(GS1)：30 Psi；輔助氣(GS2)：30 Psi。采用多反應(yīng)檢測(MRM)模式；離子對m/z 455.3→407.4；去簇電壓-50 eV,碰撞電壓-55 eV。

2.2.3 線性范圍考察 取齊墩果酸對照品溶液，用甲醇稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(4～2000 ng/mL)，進(jìn)樣，測定峰面積。以齊墩果酸對照品溶液的質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作直線回歸?；貧w方程為y=618.43x+14562(R2=0.9995)。

2.2.4 精密度考察 取齊墩果酸對照品儲備液，甲醇稀釋制備20，250，1500 ng/mL不同濃度供試品溶液，進(jìn)樣，計算精密度。RSD分別為1.2%，2.0%和1.7%(n=6)。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.5 回收率考察 在含有0.05 mmol/L的甘草酸溶液中，加入齊墩果酸對照品溶液，配制成為質(zhì)量濃度為50 ng/mL的溶液，過濾，進(jìn)樣測定。測得齊墩果酸回收率為98.2%，RSD=0.35%(n=6)。符合測定要求。

2.2.6 樣品的制備與處理 取一定量甘草酸加入90 ℃蒸餾水配制為甘草酸水溶液，外標(biāo)法確定甘草酸含量，得到1 mmol/L甘草酸溶液，稀釋得到1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0 mmol/L不同濃度甘草酸水溶液各10 mL。每種溶液分三份，每份3 mL，分別加入過量的齊墩果酸，于37 ℃恒溫氣浴振蕩器中振蕩48 h，使溶解達(dá)到平衡。取樣，用0.2 μm微孔濾膜過濾，用甲醇稀釋五倍，取1 mL進(jìn)樣，測定。

圖3 齊墩果酸空白(a)和齊墩果酸對照(b)色譜圖

2.2.7 甘草酸對齊墩果酸增溶作用 甘草酸溶液濃度的變化對齊墩果酸的溶解度的影響如圖4所示，在不加入甘草酸時，齊墩果酸在水中的溶解度為20.09 ng/mL。在加入甘草酸后，齊墩果酸的溶解度隨甘草酸溶液濃度的升高而增加，當(dāng)甘草酸濃度達(dá)到1 mmol/L時，齊墩果酸溶解度達(dá)到1155.36 ng/mL，比齊墩果酸在水中的溶解度增加約60倍。

圖4 不同濃度甘草酸溶液對齊墩果酸溶解度的影響

3 討論

本實驗研究了甘草酸對薯蕷皂苷元和齊墩果酸的增溶作用，結(jié)果顯示甘草酸表現(xiàn)出了比較明顯和穩(wěn)定的增溶效果。

甘草酸的增溶作用主要由于其結(jié)構(gòu)上，同時存在親水(兩個葡萄糖醛酸殘基)和疏水(三萜配基)部分，有類似表面活性劑的結(jié)構(gòu)特點，可以改善疏水藥物的水溶性。由于其分子中帶有的三個羧酸基團(tuán)的電離作用，甘草酸可以形成凝膠狀或膠束狀的聚集體[4]。在本實驗制備甘草酸水溶液的過程中，也觀察到了甘草酸溶液在較低溫度下放置時間稍長，會出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象。有文獻(xiàn)報道甘草酸對納米粒子表現(xiàn)出抑制晶體生長的作用，可以用作疏水納米藥物的沉淀抑制劑[7-8]。

甘草酸的增溶效果還與被增溶藥物本身的結(jié)構(gòu)特點相關(guān)。圖2和圖4的增溶曲線存在一定差異，甘草酸對不同結(jié)構(gòu)藥物的增溶作用不同。整體來看，在甘草酸濃度0～1 mmol/L范圍內(nèi)，薯蕷皂苷元和齊墩果酸的溶解度均隨甘草酸濃度的增加呈增長趨勢。

甘草酸表現(xiàn)出了非常好的改善難溶性藥物水溶性和穩(wěn)定性的性質(zhì)，并且甘草酸是一種天然成分，被證明安全，無毒性，可用作甜味劑。相比于合成的表面活性劑，在生物相容性方面有明顯的優(yōu)勢。而且不能被忽視的是，甘草酸作為一種中藥的有效成分，其本身具有一定的藥理活性。對于藥理活性與甘草酸有重合的難溶性藥物，甘草酸在提高難溶性藥物溶解度的同時，可能也會表現(xiàn)出一定的輔助藥理作用，包括增加藥效[9]，和減緩毒性[10]等。甘草酸對薯蕷皂苷元和齊墩果酸發(fā)揮藥理作用所產(chǎn)生的影響，包括是否存在協(xié)同作用，以及其它的體內(nèi)相互作用，仍需要進(jìn)一步的動物實驗進(jìn)行探究。

綜上，甘草酸具有明顯的增溶作用，可用于增加薯蕷皂苷元和齊墩果酸在水溶液中的溶解度。