大豆高隆象致病球孢白僵菌菌株BEdy1的鑒定及毒力測定

張磊，賈琦，巫蔚，趙路評，薛冰，劉歡歡，尚靜，雍太文，李慶，楊文鈺

大豆高隆象致病球孢白僵菌菌株BEdy1的鑒定及毒力測定

張磊，賈琦，巫蔚，趙路評，薛冰，劉歡歡，尚靜，雍太文，李慶，楊文鈺

（四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/四川省作物重大病害重點實驗室/帶狀復合種植工程技術(shù)研究中心，成都 611130）

【】大豆高隆象（）是我國南方大豆田間主要害蟲之一。本研究旨在明確一株高隆象自然致病真菌的種類及其生物學特性，并測定該菌株對大豆高隆象成蟲的毒力，為大豆高隆象的生物防治提供新材料。對采集的真菌進行分離、純化培養(yǎng)，形態(tài)學觀察；提取真菌DNA進而擴增rDNA-ITS，利用BLAST比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，鑒定田間致高隆象自然死亡的真菌種類；設(shè)置不同培養(yǎng)溫度，通過十字交叉法和血球計數(shù)板方法測量計算真菌生長速率和產(chǎn)孢量；配置不同濃度的球孢白僵菌（）BEdy1孢子懸浮液，采用浸蟲處理法測定對大豆高隆象的毒力，與商品化球孢白僵菌產(chǎn)品LH毒力進行對比；大豆葉片噴施BEdy1孢子懸浮液，評價高隆象取食后的致死效果。致使高隆象田間自然發(fā)病死亡的真菌為球孢白僵菌，菌株命名為BEdy1。該菌株在22—28℃有較高的生長速率，26℃下生長速率最高，達4.34 mm·d-1；在20—26℃有較高的產(chǎn)孢量，22℃下產(chǎn)孢量最大，為4.63×106孢子/mm2。濃度為1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL的BEdy1孢子懸浮液處理高隆象成蟲10 d，死亡率分別為49.33%、77.33%、88.67%和98.00%，對照死亡率僅為10%。1×108孢子/mL孢子懸浮液處理下，LT50為（6.79±0.13）d，僵蟲率為74.67%，發(fā)病嚴重度最高。10 d的LC50和LC95分別為4.80×104和3.57×107孢子/mL。濃度為1×108孢子/mL的商品化球孢白僵菌產(chǎn)品LH處理高隆象成蟲，10 d死亡率為58.00%，僵蟲率為4.67%，極顯著低于同濃度的BEdy1處理。大豆葉片噴施BEdy1孢子懸浮液后喂食高隆象，10 d死亡率為100%，僵蟲率為63.33%，LT50為（5.27±0.35）d。適當環(huán)境條件下，球孢白僵菌菌株BEdy1生長速度快，產(chǎn)孢量高，對大豆高隆象成蟲有很高的致死率，具有較大的開發(fā)應用潛力。

大豆高隆象；球孢白僵菌；生物學特性；毒力；生物防治

0 引言

【研究意義】大豆是重要的經(jīng)濟和糧油作物，具有較高的營養(yǎng)價值。在大豆生長過程中，多種病蟲害嚴重限制其產(chǎn)量。鞘翅目象甲科害蟲在全世界大豆種植區(qū)均有發(fā)生與危害，危害我國大豆的象甲科害蟲主要為大豆高隆象（）[1]。從2015年起，四川省大豆高隆象發(fā)生危害嚴重，已經(jīng)成為主要害蟲之一，而大豆高隆象的假死特性增加了防治難度?，F(xiàn)有化學藥劑針對性不強，即使大量施用仍達不到理想的防治效果。目前，未有針對大豆高隆象的有效生物防治學手段。因此，探究一種安全、有效且環(huán)保的大豆高隆象生物防治技術(shù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在美國部分地區(qū)的大豆植株發(fā)生嚴重落葉，調(diào)查發(fā)現(xiàn)主要由進口長角象甲（）危害造成[2-3]。長角象甲在20世紀40年代自日本傳入美國，田間雜草增多會導致其大量發(fā)生并造成嚴重危害[4-5]。此外，在熱帶地區(qū)如巴西、阿根廷等國家，大豆莖稈象甲（）嚴重危害大豆莖稈，損傷的莖稈阻斷了營養(yǎng)物質(zhì)輸送，導致產(chǎn)量下降[6-7]。最近，一種墨西哥大豆莢象甲（）被發(fā)現(xiàn)，其主要危害大豆莢，發(fā)生嚴重的地區(qū)豆莢損害率達48%[8]。不同種的大豆象甲取食植株部位存在差異，但最終都導致了大豆產(chǎn)量的嚴重降低。在我國，造成田間危害的象甲種類主要為大豆高隆象。該蟲從6月上旬開始發(fā)生，至10月上旬結(jié)束。成蟲蛀食莖稈、豆莢；卵被產(chǎn)在豆莢內(nèi)部，孵化以后，幼蟲在豆莢內(nèi)取食豆粒，造成嚴重危害[1]。近年來，隨著玉米-大豆復合種植技術(shù)的大面積推廣，套作大豆種植面積逐年上升[9]。據(jù)調(diào)查，在復合種植模式下大豆高隆象造成的危害遠高于其他害蟲，危害的田塊一般損失10%—20%，危害嚴重的田塊損失高達60%—70%[1]。目前，主要以化學防治手段來控制大豆高隆象。尚靜等[10]利用三唑磷或氯蟲苯甲酰胺進行田間防治，取得一定的效果，但會造成一定程度的葉片氧化脅迫損傷。相關(guān)研究表明，使用白僵菌防治象甲，如紅棕象甲（）[11]、玉米象甲（）[12]、茶大灰象甲（）[13]和紫薇梨象（）[14]等，得到了較好的效果。白僵菌是一種常見的昆蟲病原真菌，寄主范圍廣泛。其中，球孢白僵菌（）可寄生15個目700多種昆蟲，容易大規(guī)模生產(chǎn)，是目前研究和應用最多的昆蟲病原菌之一[15]。與化學農(nóng)藥相比，其對非靶標生物危害小，更加環(huán)保?！颈狙芯壳腥朦c】田間觀察到一頭自然感染真菌死亡的大豆高隆象成蟲僵蟲，采集后對該蟲生真菌進行分離、鑒定，并探究其生物學特性以及對大豆高隆象成蟲的毒力。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確自然致大豆高隆象死亡的蟲生真菌的種類和生物學特性，測定其對大豆高隆象成蟲的毒力，為防控大豆高隆象提供生物防治新材料。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

大豆高隆象每年7—9月發(fā)生率高，對莖稈和豆莢危害嚴重（圖1）。大豆高隆象成蟲收集自四川省玉米-大豆帶狀復合種植仁壽科研基地。在人工光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，溫度控制在（25±1）℃，光周期為14 L﹕10 D。飼養(yǎng)食物為采摘的新鮮豆莢，每2 d更換一次新鮮食物。

1.2 昆蟲病原真菌的收集、分離和鑒定

2018年9月，在四川省仁壽縣的大豆田中采集到一頭被真菌感染的大豆高隆象成蟲僵蟲。用消毒接種針從僵蟲蟲體上挑取霉層，接種于含100 μg·μL-1醫(yī)用鏈霉素的PDA平板上，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。5 d后，用直徑5 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA平板中央進行純化培養(yǎng)。定期觀察菌落形態(tài)特征，并利用蔡司顯微鏡Gmbh37081對分子孢子拍照觀察。

利用真菌DNA快速提取試劑盒（DN41，艾德萊，北京）對純化后的菌株進行DNA提取。使用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，反應總體系為25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。反應程序：94℃3 min；94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫對測序獲得的序列進行BLAST比對，確定其生物學分類。下載相近菌株的rDNA-ITS序列，在MEGA 7軟件中通過MUSLE比對，基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。該菌種已由本實驗室申請專利菌種保藏。

1.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株BEdy1的生長速率和產(chǎn)孢量的影響

將菌株在PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)10 d，用直徑5 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央，置于不用溫度（16、20、22、25、26、28、30和35℃）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理3個重復。10 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長速率。并用直徑5 mm的滅菌打孔器在菌落中心至邊緣1/2處打取菌餅，每個平板取3個菌餅，接入15 mL含0.2%的吐溫-80溶液中，均勻振蕩后制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定孢子濃度，計算每平方毫米的產(chǎn)孢量。

計算公式：菌落增長直徑=菌落直徑-菌餅直徑（5mm）；菌落生長速率（mm·d-1）＝菌落增長直徑/培養(yǎng)時間（10 d）；產(chǎn)孢量（個/mm2）＝孢子數(shù)/mL×15/（π×半徑2）。

1.4 菌株BEdy1對大豆高隆象成蟲的毒力測定

純化后的菌株于PDA平板上培養(yǎng)15 d，收集分生孢子，加入0.2%的吐溫-20溶液攪拌均勻，配制濃度梯度為1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液。采用浸蟲處理法[14]進行接種，具體操作：將大豆高隆象健康成蟲浸入孢子懸浮液3—5 s，迅速取出，在無菌濾紙上吸掉多余菌液，放入直徑為15 cm的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿底部墊有無菌水濕潤的濾紙，以保持濕度，頂部覆蓋通有小孔的保鮮膜來維持氣體出入。用新鮮大豆莢喂食，每2 d更換一次新的食物和濕潤濾紙。每個濃度處理50頭，重復3次，0.2%的吐溫-20溶液處理作為對照。每日定時觀察，統(tǒng)計高隆象的死亡和發(fā)病數(shù)據(jù)。購買一個商品化的球孢白僵菌產(chǎn)品（山西綠海農(nóng)藥科技有限公司），用于比較菌株對大豆高隆象的毒力差異。根據(jù)產(chǎn)品使用說明，配置最佳的使用濃度（1.0×108孢子/mL）進行如上所述的生物測定。

使用1.0×108孢子/mL孢子懸浮液噴施大豆植株（V4期），1 d后取葉片作為食物飼喂高隆象，測定真菌寄生植物對高隆象的毒力。葉柄部位用濕潤無菌棉包裹以保持水分供應，置于直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部墊有無菌水濕潤的濾紙保濕。每2 d更換一次新的食物和濕潤濾紙。每個處理30頭昆蟲，設(shè)置3個重復，0.2%的吐溫-20溶液噴施大豆葉片作為對照。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 24的概率統(tǒng)計分析計算致死中時間（LT50）。利用Excel 2007對孢子懸浮液濃度作對數(shù)轉(zhuǎn)換和死亡率做線性回歸，計算致死中濃度（LC50）和LC95。利用SPSS 24的ANOVA方法進行方差分析，通過Duncan法比較差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 昆蟲病原真菌BEdy1的形態(tài)學和分子生物學鑒定

從自然感病死亡的大豆高隆象僵蟲蟲體分離獲得純化菌株，命名為BEdy1（圖2）。菌株在PDA平板上的菌落呈白絨狀，菌落背面為淡黃色。分生孢子近球形，單孢，透明，表面光滑，直徑大小約2 μm。對菌株的rDNA-ITS進行PCR擴增，測序獲得基因片段長度為544 bp。通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)BEdy1與多個已經(jīng)公布的球孢白僵菌rDNA-ITS存在很高的序列相似性，其中與菌株JEF006（登錄號：KT280276）的rDNA-ITS相似性達99%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，菌株BEdy1以95%的支持率與球孢白僵菌聚集在一支（圖2）。結(jié)合菌株形態(tài)學結(jié)果，最終將致使大豆高隆象田間死亡的病原菌BEdy1鑒定為球孢白僵菌，GenBank登錄號為MK345993。

2.2 溫度對球孢白僵菌BEdy1生長和產(chǎn)孢的影響

在26℃下，球孢白僵菌BEdy1菌落生長速率最高，達4.34 mm·d-1。在16—30℃，菌落均能生長，而35℃下則停止生長。有利于BEdy1菌株生長的溫度為22—28℃，生長速率均在4 mm·d-1以上。該菌株在22℃下產(chǎn)孢量最大，為4.63×106孢子/mm2。20—26℃之間菌株產(chǎn)孢量較高，20、25和26℃下產(chǎn)孢量分別為2.95×106、3.63×106和3.55×106孢子/mm2，3個溫度下產(chǎn)孢量差異不顯著（表1）。

表1 不同培養(yǎng)溫度下BEdy1的生長速率和產(chǎn)孢量

數(shù)值為平均值±標準誤；不同小寫字母表示處理間顯著差異（＜0.05）。下同

Data are mean±SE. Different lowercase letters indicate significant differencesamong treatments (＜0.05). The same as below

2.3 球孢白僵菌BEdy1對大豆高隆象成蟲的毒力

不同濃度的BEdy1孢子懸浮液浸蟲處理后，第6天起試蟲死亡數(shù)開始快速增加；濃度為1×108孢子/ mL的孢子懸浮液處理，第10天死亡率接近100%；濃度為1×107、1×106和1×105孢子/mL的孢子懸浮液處理10 d后的死亡率分別88.67%、77.33%和49.33%，而對照組10 d的死亡率僅為10%；1×108孢子/mL孢子懸浮液處理的LT50為（6.79±0.13）d；隨著孢子濃度的降低，LT50值逐漸增加。僵蟲率與孢子懸浮液的處理濃度呈正相關(guān)（圖3）。1×108孢子/mL 的孢子懸浮液處理下，試蟲發(fā)病最嚴重，僵蟲率達74.67%。圖4為處理10 d后試蟲的發(fā)病情況，隨著孢子濃度的增加發(fā)病越來越重，對照組處理未見僵蟲出現(xiàn)。第10天的LC50、LC95分別為4.80×104、3.57×107孢子/mL（表2）。

A：自然感染真菌BEdy1死亡的高隆象成蟲僵蟲The cadaver of E. d. yunnanusinfected with fungus BEdy1 in the field；B：BEdy1菌落正面Front of BEdy1 colony；C：BEdy1菌落背面Back of BEdy1 colony；D：分生孢子顯微照片Micrograph of conidia；E：系統(tǒng)進化分析Phylogenetic analysis。蘇格蘭白僵菌Beauveria caledonica；蠕孢白僵菌Beauveria vermiconia；多形白僵菌Beauveria amorpha；馬拉維白僵菌Beauveria malawiensis；布氏白僵菌Beauveria brongniartii；球孢白僵菌Beauveria bassiana

B5: 1.0×105 spores/mL; B6: 1.0×106 spores/mL; B7: 1.0×107 spores/mL; B8: 1.0×108 spores/mL

孢子濃度為1×108孢子/mL的商品化球孢白僵菌產(chǎn)品LH處理大豆高隆象10 d后，死亡率僅為58.00%，僵蟲率為4.67%，極顯著低于同濃度的BEdy1處理。LT50為（9.00±0.52）d，與BEdy1處理相比差異顯著（表3）。

A: 1.0×105 spores/mL; B: 1.0×106 spores/mL; C: 1.0×107 spores/mL; D: 1.0×108 spores/mL

表2 不同時間下球孢白僵菌BEdy1對大豆高隆象的毒力

表3 商品化球孢白僵菌LH對大豆高隆象的毒力

與同濃度BEdy1處理相比 Compared with the same concentration of BEdy1 treatment。***：＜0.001；**：＜0.01

大豆植株外施濃度為1×108孢子/mL的BEdy1孢子懸浮液，葉片喂食大豆高隆象。第5天開始，大豆高隆象死亡數(shù)快速增加；至第10天，死亡率達100%。LT50為（5.27±0.35）d，第10天僵蟲率為63.33%（圖5）。

圖5 葉面噴施BEdy1對大豆高隆象的毒力

3 討論

對害蟲的防治方法主要包括化學防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等措施?；瘜W藥劑雖然防治效果顯著，防治成本低，但長期大量使用對非靶標生物和環(huán)境產(chǎn)生一定影響，且害蟲產(chǎn)生抗藥性，導致再猖獗[16]。栽培措施的改變，抗（耐）蟲品種的選育，一定程度上可以減輕蟲害的發(fā)生，但仍然難以完全控制害蟲。近年來，人們對于食品安全愈加重視，綠色農(nóng)業(yè)已經(jīng)成為未來農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢。生物防治對人畜安全，對環(huán)境影響小，具有較好的發(fā)展前景，其中利用昆蟲病原真菌防治害蟲，方法簡便，效果較好，引起了廣泛的重視[17]。

昆蟲病原真菌可以寄生于昆蟲體內(nèi)，導致昆蟲死亡。對蟲生真菌的分離鑒定、生物學特性研究是開發(fā)運用的首要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的真菌分類以生物學特征進行，由于真菌種類眾多，個體多態(tài)性等原因易造成假陽性的結(jié)果。隨著分子生物學的快速發(fā)展，使真菌的分類鑒定快速、準確。Rehner等[18]利用ITS和EF-1對86株白僵菌進行分類，確定了6種白僵菌的分類地位。本研究中，通過形態(tài)學觀察，結(jié)合ITS序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了致使大豆高隆象田間死亡的真菌BEdy1為球孢白僵菌。溫度對真菌的生長十分重要[19]，本研究中球孢白僵菌菌株BEdy1在22—28℃之間生長和產(chǎn)孢較好，與之前的研究結(jié)果基本一致[20-21]。劉召等[22]研究發(fā)現(xiàn)，溫度和光照對白僵菌的菌絲生長和孢子產(chǎn)生存在影響，一定條件下的低溫有利于孢子產(chǎn)生，22℃下孢子產(chǎn)生密度最大，這與本文的研究結(jié)果一致。

王定鋒等[23]利用1.0×108孢子/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液處理柑橘灰象甲（）成蟲7 d后，累計死亡率達100%；王定鋒等[13]測定了布氏白僵菌對茶大灰象甲的毒力，結(jié)果表明5.0×107孢子/mL的孢子懸浮液處理7 d，茶大灰象甲累計死亡率達100%；宋曉兵等[24]研究表明，一株分離自柑橘木虱（）的球孢白僵菌在孢子懸浮液濃度為1.0×108孢子/mL時，處理柑橘木虱成蟲7 d，其校正死亡率為95.7%。本研究中獲得的球孢白僵菌菌株BEdy1在濃度為1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液處理10 d后，大豆高隆象的死亡率近100%，同時有較高的僵蟲率，毒力顯著高于商品化球孢白僵菌。研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌可以在葡萄葉片內(nèi)生，有效降低粉蚧等刺吸昆蟲取食[25]。也可以內(nèi)生于玉米葉片，從而影響蚜蟲生長和繁殖[26]。本研究中，球孢白僵菌BEdy1孢子懸浮液噴施大豆葉片，對大豆高隆象同樣有較好的毒殺效果。RUSSO等[27]研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌處理大豆葉片，7 d內(nèi)真菌定殖率達100%，并且改善了多項大豆生長參數(shù)，可增加大豆產(chǎn)量。因此，利用球孢白僵菌防治大豆高隆象具有較大的潛力。

4 結(jié)論

致使大豆高隆象田間死亡的蟲生真菌菌株BEdy1為球孢白僵菌，該菌株在適當環(huán)境條件下生長速度快，產(chǎn)孢量高，并對大豆高隆象具有較高的致死率，有望開發(fā)成為高效防治大豆高隆象的生防藥劑。

致謝：本研究得到四川農(nóng)業(yè)大學郭銘老師、嚴靂和李倩倩同學的幫助，在此一并致謝！

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Species Identification and Virulence Determination ofStrain BEdy1 from

ZHANG Lei, JIA Qi, WU Wei, ZHAO LuPing, XUE Bing, LIU HuanHuan, SHANG Jing, YONG TaiWen, LI Qing, YANG WenYu

(College of Agronomy, Sichuan Agricultural University/Sichuan Key Laboratory for Major Crop Diseases/Sichuan Engineering Research Center for Crop Strip Intercropping System, Chengdu 611130)

【】has become one of the main pests in soybean fields in southern China. The objective of this study is to investigate the species and biological characteristics of an entomopathogenic fungus that naturally caused the death of, determine the virulence of this fungal strain toadults, and to provides a new way for biological control of.【】The fungus fromwas isolated and purified, and the fungal DNA was extracted for amplification of rDNA-ITS. Subsequently, BLAST alignment and phylogenetic tree construction were used to identify fungal species that caused the natural death of. The growth rate and sporulation of the fungus were measured by cross method and hemocytometer method at different culture temperatures.The virulence of fungus BEdy1 towas assessed on the lethality of the pests by treatment with different concentrations of spore suspension and estimated by comparison with the commercial fungal agent LH. Finally, the soybean leaves sprayed with BEdy1 spore suspension were used to evaluate the lethal effect afterfeeding.】The fungus caused the death ofunder natural conditions was identified as, named BEdy1. BEdy1 had a high growth rate at 22-28℃, and the highest growth rate was 4.34 mm·d-1at 26℃. There was a high sporulation at 20-26℃, and the highest sporulation was 4.63×106spores/mm2at 22℃.The mortality at 10th day ofadults treated with 1.0×105, 1.0×106, 1.0×107and 1.0×108spores/mL ofBEdy1 spore suspension was 49.33%, 77.33%, 88.67% and 98.00%, respectively. The mortality of the control treatment was only 10%. The effect was best under the treatment of 1×108spores/mL, with the LT50of (6.79±0.13) d and the cadaver rate of 74.67%. The LC50and LC95at 10th day were 4.80×104and 3.57×107spores/mL, respectively. Treatment with 1×108spores/mL of a commercialagent LH, the mortality and cadaver rate at 10th day were only 58.00% and 4.67%, which were significantly lower than those of the same concentration of BEdy1 treatment.After 10 days offeeding on BEdy1 treated soybean leaves,the mortality and cadaver rate were 100% and 63.33%, respectively, and the LT50was (5.27±0.35) d. 【】Under appropriate conditions, thestrain BEdy1 has fast growth rate, high sporulation, and high lethality rate toadults, which has great potential for development and application in the future.

;; biological characteristics; virulence; biological control

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.14.020

2019-11-20；

2019-12-25

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0200707，2018YFD0201006）、“國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川豆類雜糧創(chuàng)新團隊”專項資金（sccxtd-2020-20）

張磊，E-mail：zhanglei5281@126.com。通信作者尚靜，E-mail：shangjing_edu@163.com

（責任編輯 岳梅）