正交試驗(yàn)優(yōu)選清肺排毒合劑（新冠1號(hào)）制備工藝

黃銳　楊思進(jìn)　蒲清榮　羅群　趙劍　賴慧　李靜　王饒瓊　任維

摘要：目的優(yōu)選清肺排毒合劑制備工藝。方法以黃芩苷為檢測(cè)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選清肺排毒合劑的水提工藝，并驗(yàn)證工藝的可靠性。結(jié)果最佳制備工藝是：12倍水浸泡0.5 h，提取2次，每次1 h;每劑收集芳香水40 mL，水提液減壓濃縮至200 mL，20000 r/min離心2次。結(jié)論優(yōu)選的水提離心工藝合理可行，穩(wěn)定可靠，具可操作性和重復(fù)性。

關(guān)鍵詞：清肺排毒合劑（新冠1號(hào)）;黃芩苷;正交試驗(yàn);芳香水;水提;離心

中圖分類號(hào)：R965.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2020）04-0005-03

為了防控新型冠狀病毒感染的肺炎疫情，2020年2月6日國(guó)家衛(wèi)生健康委和國(guó)家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)文推薦在中西醫(yī)結(jié)合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用清肺排毒湯（國(guó)中醫(yī)藥辦醫(yī)政函〔2020〕22號(hào)）。清肺排毒方由漢代張仲景所著《傷寒雜病論》中的多個(gè)治療由寒邪引起的外感熱病的經(jīng)典方劑優(yōu)化組合而成，包括麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯和五苓散，組方合理，性味平和[1]，含麻黃、桂枝、炙甘草等二十一味藥，其功能為疏通三焦、清肺排毒、平喘止咳，可用于治療新型冠狀病毒感染的肺炎輕型、普通型、重型患者，在危重癥患者救治中也可結(jié)合患者實(shí)際情況合理使用。為方便新型冠狀病毒肺炎患者攜帶和使用，以及保證其質(zhì)量，課題組將其開發(fā)成合劑—清肺排毒合劑，本試驗(yàn)以黃芩苷為檢測(cè)指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)選清肺排毒合劑的最佳制備工藝，為全國(guó)正在生產(chǎn)清肺排毒合劑的單位提供參考。

1儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD20A檢測(cè)器、CTO-10AS進(jìn)樣器、LcSolution色譜工作站）;AUW120D電子天平（日本島津）;JA203H型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）;HH數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）;JP全數(shù)字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）;TU-1901紫外可見風(fēng)光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（杭州匯110715-201308，供爾儀器服務(wù)有限公司）。黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為含量測(cè)定用）;麻黃、桂枝、炙甘草、杏仁等藥材（購(gòu)自瀘州百草堂中藥飲片有限公司，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院蒲清榮主任中藥師鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2015年版一部該藥材項(xiàng)下規(guī)定）;甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1水提工藝的正交設(shè)計(jì)采用正交試驗(yàn)法對(duì)清肺排毒合劑的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。選取加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素3水平，以黃芩苷的相對(duì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，正交因素水平見表1。

2.2含量測(cè)定

2.3.1黃芩苷色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500[2-3]。

2.3.2黃芩苷對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品45.87 mg，用甲醇定容至50 mL棕色量瓶中，精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得0.068 472 mg·mL-1溶液。

2.3.3供試品溶液的制備精密稱取麻黃9 g，炙甘草6 g，杏仁9 g，生石膏30 g，桂枝9 g，澤瀉9 g，豬苓9 g，白術(shù)9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黃芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，冬花9 g，射干9 g，細(xì)辛6 g，山藥12 g，枳實(shí)6 g，陳皮6 g，藿香9 g，分別按表1正交因素水平表進(jìn)行試驗(yàn)，浸泡，水煎煮，過(guò)濾，濃縮，定容至250 mL容量瓶中，搖勻，精密量取2.5 mL置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.2 mL置25 mL量瓶中，分別吸取2 mL，4mL，6 mL，8 mL，10mL置10 mL量瓶中，分別用甲醇定容至相應(yīng)刻度，搖勻，制得濃度分別為6.85，171.19，342.37，513.56，684.75，855.93 μg·mL-1的溶液，依次吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），黃芩苷的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=32245X-288027，r2=0.9994（n=6）。

2.3.5精密度試驗(yàn)取2.3.4項(xiàng)下濃度為171.19 μg·mL-1對(duì)照品溶液10 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得黃芩苷平均峰面積5355031，RSD為1.60%。表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.3.3項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別于放置0，1.5，3，6，9，12 h各進(jìn)樣一次，每次10 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)黃芩苷峰面積，RSD分別為1.45%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7重復(fù)性試驗(yàn)取正交因素表1中正交試驗(yàn)提取液5號(hào)樣品，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備6份供試品，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積計(jì)算黃芩苷成分含量，RSD分別為1.22%。表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.8回收率試驗(yàn)取9份已知含量的樣品，分為3組，每組加入適量的黃芩苷對(duì)照品，按2.3.3項(xiàng)下制備9份供試品溶液，按2.3.1下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果黃芩苷收率分別為100.64%（RSD為1.18%）。表明此方法可行。

2.3.9專屬性試驗(yàn)精密量取供試品溶液缺黃芩苷的陰性樣品，按供試品制備方法制備，測(cè)定，結(jié)果表明黃芩苷其他組分對(duì)測(cè)定黃芩苷無(wú)干擾，本方法專屬性強(qiáng)。

2.3.10耐用性取正交因素表1中正交試驗(yàn)提取液5號(hào)樣品，按供試品制備方法制備，分別在色譜條件小的變動(dòng)條件下：波長(zhǎng)280±2nm，柱溫40±5℃，測(cè)定黃芩苷含量，結(jié)果表明：波長(zhǎng)、柱溫小的變動(dòng)時(shí)耐用性合適，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，本方法可靠。

2.3.11樣品測(cè)定按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定2.3.3項(xiàng)下供試品溶液中黃芩苷的含量，結(jié)果見圖1。

2.4試驗(yàn)結(jié)果以及數(shù)據(jù)分析

2.4.1芳香水收集工藝研究清肺排毒合劑方中藥材含較多揮發(fā)性成分，為了保留其揮發(fā)性成分，考察每劑收取芳香水的體積。按處方比例稱取藥材，加入10倍水，收集芳香水，每次10 mL，收集10次，稀釋100倍后，用紫外可見分光光度計(jì)在200-400 nm光譜掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前4次有較強(qiáng)的吸收，第5次吸收光度顯著降低。故確定芳香水提取工藝為每劑收集40 mL芳香水。

2.4.2水提工藝采用正交試驗(yàn)優(yōu)選清肺排毒合劑的水提工藝，按處方比例稱取藥材，進(jìn)行正交因素表1的9組試驗(yàn)，按2.3.3水提供試品溶液制備樣品，2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以黃芩苷相對(duì)含量為指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表2，表3。

由方差分析結(jié)果可知，D因素提取次數(shù)對(duì)于指標(biāo)影響最大，經(jīng)直觀分析，其影響大小的順序?yàn)樘崛〈螖?shù)>加水量>煎煮時(shí)間>浸泡時(shí)間，綜合考慮，得最佳水提條件為A3B1C2D2，即加入12倍水，浸泡0.5 h，提取2次，每次1 h。

2.4.3水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)按處方比例稱取藥材，以最佳水提工藝條件，進(jìn)行3次試驗(yàn)，測(cè)得黃芩苷的平均相對(duì)含量為53.57 mg·g-1，RSD為0.98%。優(yōu)于正交9次試驗(yàn)，證明上述正交試驗(yàn)所得到的最佳水提工藝可行，重現(xiàn)性好。

2.4.4離心工藝研究為了除去不溶于水的雜質(zhì)，減少有效成分的損失，便于患者服用，以及考慮實(shí)際生產(chǎn)，對(duì)其離心工藝進(jìn)行了研究。以離心轉(zhuǎn)速20000 r/min，進(jìn)液流速為3 L/min，考察了離心次數(shù)對(duì)液體沉淀量的影響。離心1次，沉淀依然較多，而離心2次和3次沉淀明顯減少，但相差不大，故從實(shí)際生產(chǎn)出發(fā)，選擇離心2次。

3討論

清肺排毒合劑處方來(lái)源于國(guó)家中醫(yī)藥管理局辦公室、國(guó)家衛(wèi)健委辦公廳聯(lián)合印發(fā)的《關(guān)于推薦在中西醫(yī)結(jié)合救治新型冠狀病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒湯”的通知》，前期臨床觀察療效顯著。但湯劑服用、攜帶不方便，也不利于及時(shí)搶救危重病人，易發(fā)霉、發(fā)酵、不能久貯等，結(jié)合清肺排毒方處方量大，芳香水多，將該方開發(fā)成合劑，每劑250 mL，保留了湯劑的優(yōu)點(diǎn)，還方便新冠肺炎患者攜帶和服用，保證質(zhì)量。

黃芩作為清肺排毒方中重要組成藥味，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。主治溫?zé)岵　⑸虾粑栏腥?、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎動(dòng)不安、高血壓、癰腫癤瘡等癥[4-5]。所含有效成分主要是黃酮及其苷類、萜類化合物及揮發(fā)油等成分[6-7]。黃芩的主要有效成分黃芩苷[8]具有抑菌、抗炎、降壓、抗變態(tài)反應(yīng)等藥理作用，臨床上可用于肺炎、腦缺血、肝炎、感染和腫瘤等疾病治療。黃芩苷檢測(cè)方便，穩(wěn)定性好。故，選擇黃芩苷作為優(yōu)選清肺排毒合劑水提工藝的成分指標(biāo)。

本試驗(yàn)選擇離心工藝作為清肺排毒合劑澄清工藝的方式，未采用傳統(tǒng)的水提醇沉。工藝中加入乙醇沉淀，時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加，且滅菌后跟離心工藝處理的樣品，沉淀量差不多，故采用離心工藝。

參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2020-04-02）

基金項(xiàng)目：國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治新型冠狀病毒肺炎應(yīng)急研究專項(xiàng)課題（編號(hào)：2020ZYLCYJ02-3）;西南醫(yī)科大學(xué)-西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院聯(lián)合項(xiàng)目（編號(hào)：2020XYLH-003）

作者簡(jiǎn)介：黃銳（1986-），男，主管中藥師，碩士，研究方向：中藥新制劑研究。

通信作者：楊思進(jìn)，E-mail：ysjimn@sina.com