從消毒前后肉雞場空舍期細(xì)菌群落組成探討不同籠養(yǎng)模式的優(yōu)缺點(diǎn)

孫秋艷，林婷婷，杜燕，李叢叢，夏慶祥，李舫*

(1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東省畜禽抗菌藥物使用減量化工程技術(shù)研究中心，山東 濰坊 261061;2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109)

家禽養(yǎng)殖業(yè)中，養(yǎng)殖場內(nèi)環(huán)境的控制是最重要的環(huán)節(jié)，細(xì)菌可形成微生物氣溶膠。許多病原微生物可通過微生物氣溶膠進(jìn)行傳播[1-2]，因此控制微生物氣溶膠傳播的常用方法就是消毒[3-4]。但是不同的消毒模式對(duì)消毒效果影響較大，理想的消毒模式具有較好的殺死病原微生物的能力，能有效保持雞場的環(huán)境衛(wèi)生。當(dāng)今我國肉雞養(yǎng)殖籠養(yǎng)模式非常多，有標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)模式，也有地面平養(yǎng)模式和網(wǎng)上平養(yǎng)模式改成籠養(yǎng)模式的。本研究采用FA-3型氣溶膠粒度分布采樣器，對(duì)山東標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)、網(wǎng)上平養(yǎng)和地面平養(yǎng)改建籠養(yǎng)的肉雞場，其空舍期消毒前后進(jìn)行空氣細(xì)菌采樣。應(yīng)用Illumina HiSeq PE250雙末端測序法[5-6]，對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行測序，使用Qiime軟件對(duì)細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，探討不同籠養(yǎng)模式的優(yōu)缺點(diǎn)，分析空舍期消毒劑的有效性，以形成指導(dǎo)家禽生產(chǎn)的籠養(yǎng)模式的生物安全技術(shù)規(guī)程。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

FA-3型(是型號(hào))氣溶膠粒度分布采樣器、玻璃纖維濾膜為遼陽市康潔儀器研究所產(chǎn)品。

1.2 雞舍情況

分別在山東濰坊諸城(Z)、安丘(A)、昌邑(X)各選取一個(gè)籠養(yǎng)肉雞場進(jìn)行采樣，養(yǎng)殖模式均為3層立體籠養(yǎng)，其中雞場X是標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)雞場， Z雞場是地面平養(yǎng)改建，A雞場是地面網(wǎng)養(yǎng)改建。采樣時(shí)室外溫度均為24～29 ℃，濕度均為55%～70%。

1.3 消毒模式

第1次消毒：清水沖洗后，1∶500戊二醛癸甲溴銨消毒液噴灑消毒雞舍。

第2次消毒：固體甲醛2 g/ m3舍熏蒸消毒12 h，然后再密閉12 h；第3次消毒：0.5%戊二醛噴灑消毒。

1.4 樣品采集

樣品采集用3點(diǎn)采樣法。采樣位置分別為舍內(nèi)對(duì)角線中心中點(diǎn)、離對(duì)角線中心中點(diǎn)12 m 等距的2 個(gè)點(diǎn)(見圖1)。在距地面1.2 m處，用FA-3型氣溶膠粒度分布采樣器(氣流速度28.3 L/min，驅(qū)動(dòng)時(shí)間1 h)，采集空舍期消毒前和消毒后的樣品，雞糞清理沖洗完作為消毒前樣品數(shù)據(jù)，消毒后72 h采樣作為消毒后樣品數(shù)據(jù)。因此諸城(Z)雞場消毒前為Z1，消毒后為Z2；安丘(A)雞場消毒前為A1，消毒后為A2；昌邑(X)雞場消毒前為X1，消毒后為X2。樣品采集時(shí)，采樣人員與雞場工作人員均遠(yuǎn)離采樣器。將3個(gè)采樣點(diǎn)的8層吸附有樣品的玻璃纖維濾膜混在一起裝入無菌封口聚乙烯袋中，做好標(biāo)記，0 ℃帶回實(shí)驗(yàn)室，冷凍備用。

圖1 3個(gè)舍的采樣點(diǎn)位置

1.5 DNA提取與測序

將不同時(shí)間采集的8層玻璃纖維濾膜，用PBS作為溶解液進(jìn)行合并溶解后作為一個(gè)樣本。濃縮含有微生物的溶解液，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，提取的樣本DNA送至北京諾禾致源科技有限公司，應(yīng)用Illumina HiSeq PE250雙末端測序法，對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)(341F～806R)進(jìn)行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)Illumina測序的序列進(jìn)行拼接、過濾、質(zhì)控、剔除嵌合體，最終得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。用Uparse軟件，對(duì)所有樣品在97%相似度下的有效數(shù)據(jù)聚類并作為分類操作單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，分析統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用Qiime軟件計(jì)算樣品的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、譜系多樣性指數(shù)(Phylogenetic diversity，PD)、指數(shù)的Alpha多樣性(Alpha Diversity)值[7]，進(jìn)行Beta多樣性(Beta Diversity)組間差異分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品測序結(jié)果

對(duì)籠養(yǎng)肉雞舍空舍期空氣中細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)(341F～806R)進(jìn)行測序，序列信息見表1。從OUT的個(gè)數(shù)可以看出，雞場Z、A、X 的OTUs消毒后均比消毒前有所降低。消毒效果最好的是X雞場，其次是A雞場，最后是Z雞場。

表1 樣本的序列信息

2.2 細(xì)菌群落的α多樣性分析

2.2.1 取樣深度驗(yàn)證

稀釋曲線(Rarefaction Curve)是以隨機(jī)抽取的序列數(shù)據(jù)為橫坐標(biāo)，序列對(duì)應(yīng)OTUs的數(shù)目為縱坐標(biāo)構(gòu)建的曲線，可直接反映測序數(shù)據(jù)量是否合理，還可間接反映樣品中物種的豐富程度。6個(gè)樣品的稀釋曲線如圖2所示，曲線已趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸接近合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息，再增大數(shù)據(jù)量對(duì)新物種的發(fā)現(xiàn)貢獻(xiàn)很小，因此，此次測序的結(jié)果可代表樣品的真實(shí)情況。

圖2 6個(gè)樣品的稀釋曲線

2.2.2 細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)分析

α多樣性指數(shù)分析是通過Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指數(shù)，對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析。其中，Shannon指數(shù)是指綜合物種豐度和物種均勻度兩方面因素的多樣性指數(shù)，其值越大表明樣品中物種的多樣性越高；Simpson指數(shù)體現(xiàn)樣品中物種豐度指數(shù)，其值越大表明樣品中物種的多樣性越高；PD指數(shù)反映了物種組成的系統(tǒng)進(jìn)化特征的多樣性，其值越大則表示樣品中物種越豐富；Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)樣品中物種豐富度，其值越大則表示樣品中物種越多；取樣覆蓋率則反映了測序結(jié)果是否覆蓋了樣本物種數(shù)。由表2可以看出，Z雞場消毒后Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指數(shù)均大于消毒前，說明消毒后細(xì)菌種類反而增多；A雞場和X雞場消毒后Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指數(shù)均小于消毒前，但X雞場α多樣性指數(shù)降低比較大。

表2 樣品的α多樣性指數(shù)

2.2.3 細(xì)菌群落多樣性的花瓣圖

圖3直觀展示了6個(gè)樣品共有6個(gè)相同的OTUs，表明消毒劑對(duì)這6個(gè)物種作用不大，消毒后A雞場OTUs數(shù)量減少，X雞場OTUs數(shù)量顯著減少，僅剩1種，Z雞場消毒后OTUs數(shù)量反而增多，表明空舍期消毒效果較好的是X雞場，其次是A雞場。

花瓣圖中每個(gè)花瓣代表一個(gè)樣品，不同的顏色代表不同的樣品，中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTUs數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣品特有的OTUs數(shù)目圖3 6個(gè)樣本的花瓣圖

2.3 細(xì)菌群落的Beta多樣性分析

基于非加權(quán)法(unweighted unifrac)和加權(quán)法(weighted unifrac)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis， PCoA)來研究Beta多樣性，研究結(jié)果見圖4。3個(gè)雞場消毒前和消毒后細(xì)菌群落組成差異較大，多樣性具有明顯區(qū)分，從圖4中可以看出，X雞場消毒前和消毒后細(xì)菌群落組成差異最大，其次是A雞場，最后是Z雞場。

圖4 Beta多樣性的PCoA分析

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平細(xì)菌組成分析

各樣品在門分類水平上細(xì)菌組成分析見圖5。6個(gè)樣品共得到16種細(xì)菌類群，變形菌門(Proteobacteria)不論是在消毒前還是在消毒后均是優(yōu)勢菌群，相對(duì)豐度87.4%～99.3%，其次是厚壁菌門(Firmicutes)，相對(duì)豐度0.33%～17.9%，然后是擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對(duì)豐度0.1%～8.1%，其他門含量較低。由圖5表明，X雞場消毒后細(xì)菌門水平上種類非常少，A雞場消毒后細(xì)菌種類也相應(yīng)減少，Z雞場消毒后細(xì)菌種類反而增多。

圖5 門水平細(xì)菌組成分析

2.4.2 屬水平細(xì)菌組成分析

各樣品在屬分類水平上細(xì)菌組成分析見圖6。6個(gè)樣品共得到95種細(xì)菌類群，葉桿菌屬(Phyllobacterium)除A雞場消毒前外均是優(yōu)勢菌群，其次是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和勞爾斯菌屬(Ralstonia)。由圖6表明，A雞場消毒前優(yōu)勢菌群消毒后完全消失，X雞場消毒后細(xì)菌屬水平上種類非常少，A雞場消毒后細(xì)菌種類也相應(yīng)減少，Z雞場消毒后細(xì)菌種類反而增多。

圖6 屬水平細(xì)菌組成分析

2.5 細(xì)菌豐度聚類分析

為研究消毒前和消毒后禽舍空氣中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，根據(jù)所有樣品在屬水平的豐度信息，選取豐度排名前35的屬，從物種和樣品兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，結(jié)果見圖7。3個(gè)雞舍中，消毒前相對(duì)豐度最高的菌群，在消毒劑處理后明顯降低，尤其是X雞場消毒后，熱圖中未出現(xiàn)紅色方塊，表明消毒后舍內(nèi)細(xì)菌的含量非常低。但是Z雞場消毒后出現(xiàn)大面積的紅色方塊，說明Z雞場消毒后某些細(xì)菌種類開始增多。

縱向?yàn)闃悠沸畔ⅲ瑱M向?yàn)槲锓N注釋信息；熱圖對(duì)應(yīng)的值為每一行物種相對(duì)豐度經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的Z值，即一個(gè)樣品在某個(gè)分類上的Z值為樣品在該分類上的相對(duì)豐度和所有樣品在該分類的平均相對(duì)豐度的差除以所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差所得到的值。顏色越紅表明豐度越高圖7 微生物聚類熱圖

3 討論

孫秋艷等[8-9]通過傳統(tǒng)的自然沉降法、FA-1型六級(jí)篩孔撞擊式空氣微生物采樣器等方法對(duì)空氣中微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，存在工作量大、自然界微生物培養(yǎng)有限等問題，導(dǎo)致只能檢測到部分微生物或特定病原微生物，在種類和數(shù)量的分析上存在很大局限性[10]。Illumina HiSeq PE250雙末端測序法成功解決了通量低、準(zhǔn)確率低、操作復(fù)雜等問題，與傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法相比，能夠檢測到更多的微生物基因信息，更加全面、準(zhǔn)確地闡明微生物群落結(jié)構(gòu)特征[11-12]。

X雞場是標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)雞場，具有自動(dòng)清糞設(shè)備，自動(dòng)混合通風(fēng)，具有數(shù)控裝備，隨時(shí)監(jiān)控舍內(nèi)溫度、濕度等功能，雞舍規(guī)格110 m×13.5 m×3.5 m，舍內(nèi)地面光滑；Z雞場是地面平養(yǎng)改建的，人工清糞，縱向負(fù)壓通風(fēng)(仍然是老的通風(fēng)設(shè)備)，無數(shù)控裝備，雞舍規(guī)格110 m×14 m×3.5 m，舍內(nèi)地面凹凸不平；A雞場是地面網(wǎng)養(yǎng)改建，人工清糞，縱向負(fù)壓通風(fēng)，無數(shù)控裝備，雞舍規(guī)格120 m×14 m×3.5 m，舍內(nèi)地面光滑。α多樣性指數(shù)和花瓣圖分析可以看出，Z雞場消毒后細(xì)菌種類反而增多，A雞場和X雞場消毒后空氣中細(xì)菌種類相對(duì)于消毒前明顯減少，可能由于Z雞場消毒后，舍內(nèi)地面凹凸不平，消毒后殘留水分較多，有利于微生物滋生，且通風(fēng)效果不好。可見，空氣中細(xì)菌種類與通風(fēng)設(shè)施、通風(fēng)時(shí)間、舍內(nèi)地面及時(shí)干燥等因素有關(guān)。細(xì)菌豐度聚類結(jié)果表明，空舍期消毒后，雞舍中相對(duì)豐度最高的菌群，在消毒后明顯降低，由此表明，籠養(yǎng)雞舍空舍期消毒具有一定效果。

Beta多樣性是對(duì)不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。細(xì)菌群落的PCoA分析結(jié)果表明，3個(gè)雞場消毒前和消毒后群落組成差異較大，多樣性具有明顯區(qū)分，表明消毒具有一定效果。

3個(gè)雞舍均位于山東濰坊，養(yǎng)殖模式均為3層立體籠養(yǎng)，采樣時(shí)間均為2018年4至5月份，采樣時(shí)室外溫度均為24～29 ℃，濕度均為55%～70%，因此，3個(gè)雞舍所處的環(huán)境條件相差不大。通過細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，在門水平上，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為三大優(yōu)勢菌群，其中變形菌門的豐度最高；在屬分類水平上，A雞場消毒前優(yōu)勢菌群在消毒后完全消失，消毒后3個(gè)雞場優(yōu)勢菌群為葉桿菌屬(Phyllobacterium)，其次是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和勞爾斯菌屬(Ralstonia)，因此飼養(yǎng)模式對(duì)消毒后致病菌種類沒有影響。不論消毒前還是消毒后，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)豐度都較高，可引起動(dòng)物呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、傷口及皮膚感染和泌尿生殖道感染等。不動(dòng)桿菌屬在消毒前后空氣樣本中一直存在，由此說明，3個(gè)雞舍消毒后檢測到致病菌與環(huán)境沒有關(guān)系，空舍期消毒可能對(duì)其作用不大。所以，建立籠養(yǎng)肉雞場科學(xué)有效的生物安全體系就顯得尤為重要。