一例波爾山羊口瘡病的實(shí)驗(yàn)室診斷

●史冠英 王 濤※ 徐 敏 劉文偉 張 震

（1.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心新疆烏魯木齊830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆烏魯木齊830063）

羊口瘡又稱羊傳染性膿皰[1]，是由羊口瘡病毒引起的綿羊和山羊的一種接觸性傳染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征[2]。口蹄疫病毒(FMDV)屬于小RNA病毒科，羊通過(guò)接觸病羊或病羊排泄物感染[3]。羊感染口蹄疫發(fā)病后一般不致死，但會(huì)使病羊的口、蹄部出現(xiàn)大量水皰，高燒不退。羊痘（Qrf）是由羊痘病毒所致，羊痘病毒是一種對(duì)乙醚敏感的脫氧核糖核酸（DNA）病毒，該病毒主要侵染羊[4]，人接觸病羊或病羊污染的物質(zhì)也會(huì)被感染，因此羊痘是一種人畜共患病[5]。以上這三種傳染病羊均易感，且表現(xiàn)出的臨床癥狀極為相似，有時(shí)很難在臨床上做出區(qū)別[6]，這也是基層獸醫(yī)在開展工作時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到的瓶頸。本文以實(shí)驗(yàn)室診斷的方法確診了一例疑似感染羊口瘡病毒的病例，將臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)合起來(lái)對(duì)疾病做出確診，旨在為基層獸醫(yī)工作者在疾病診斷方面提供科學(xué)依據(jù)，使農(nóng)牧民避免遭受大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑加抗生素（慶大霉素、左旋氧氟沙星、阿奇霉素）的PBS-甘油棉拭子保存液（pH7.2-7.6）；哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司提供的柱式核酸提取試劑盒，批號(hào)：YRNA-TQ 20190926P；洛陽(yáng)萊普生信息科技有限公司提供的口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：CP20190612；羊痘病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：XP20190912；羊口瘡病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：WP20191112。

1.1.2 儀器高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，型號(hào)：3K15；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)：QuantStudio 5；電熱式恒溫水浴鍋購(gòu)自北京市醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：DM0421；可調(diào)式漩渦振蕩器購(gòu)自大龍器械有限公司，型號(hào)：MX-S；瞬時(shí)離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，型號(hào)：MinX-5；全自動(dòng)組織研磨儀購(gòu)自法國(guó)BERTIN公司，型號(hào)：PEVO62。

1.1.3 樣本病原學(xué)樣本：該養(yǎng)殖戶共飼養(yǎng)89只波爾山羊，與發(fā)病羊只同圈的有26只，其中僅1只羊表現(xiàn)出臨床癥狀，具體癥狀表現(xiàn)為在口、唇、鼻附近有丘疹、水皰樣結(jié)節(jié)。采集水皰皮3份、水皰液2份，放入1.5ml離心管內(nèi)，置于有冰袋的采樣箱內(nèi)，及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。

棉拭子樣本：對(duì)發(fā)病羊只所在圈舍分點(diǎn)采集10份環(huán)境棉拭子樣本，對(duì)病羊接觸過(guò)的采食槽、飲水槽及圍欄分點(diǎn)采集10份棉拭子樣本，采集后的樣本放在裝有冰袋的采樣箱內(nèi)，送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 樣本滅活將采集的水皰皮、水皰液及環(huán)境棉拭子樣本放入恒溫水浴鍋中56℃，30min滅活。

1.2.2 病毒核酸提取將水浴鍋中的病原學(xué)樣本及棉拭子樣本取出后，置于振蕩器充分震蕩，3份水皰皮經(jīng)全自動(dòng)組織研磨儀研磨、混勻后，高速冷凍離心機(jī)12 000r離心1min，收集上清液，參照柱式核酸提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行核酸提取，提取后的核酸放置于20℃的條件下保存待檢測(cè)。

1.2.3 病原學(xué)樣本羊痘、羊口瘡及通用型口蹄疫病毒核酸檢測(cè)

將提取的病毒核酸按照羊痘、羊口瘡及通用型口蹄疫病毒熒光定量檢測(cè)劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系、設(shè)置熒光PCR儀程序，收集檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 環(huán)境棉拭子樣本羊痘、羊口瘡及通用型口蹄疫病毒核酸檢測(cè)

將提取的核酸按照羊痘、羊口瘡及通用型口蹄疫病毒熒光定量檢測(cè)劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系、設(shè)置熒光PCR儀程序，收集檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊痘病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

圖1 羊痘病毒核酸熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

共采集25份病原學(xué)樣本，其中3份水皰皮、2份水皰液、20份環(huán)境棉拭子樣本，經(jīng)檢測(cè)羊痘病毒核酸均為陰性，具體結(jié)果見圖1。說(shuō)明該病羊表現(xiàn)出的臨床癥狀不是羊痘病毒引起的，應(yīng)結(jié)合其他兩種可能進(jìn)行鑒別。羊痘具體的臨床癥狀表現(xiàn)為初起為紅色或紫紅色的小丘疹，質(zhì)地堅(jiān)硬，以后擴(kuò)大成為頂端扁平的水皰、后擴(kuò)大成扁平出血性大皰或膿皰，中央可有臍凹并結(jié)痂，大小為3～5cm。波爾山羊感染羊痘后臨床癥狀有一個(gè)發(fā)展的過(guò)程，典型的癥狀才能表現(xiàn)出來(lái)。水皰皮呈淡褐色，這與口蹄疫病毒具體臨床癥狀有細(xì)微的差異，這也可能是在臨床上這兩種病的根本區(qū)別。

2.2 通用型口蹄疫病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

共采集25份病原學(xué)樣本，其中3份水皰皮、2份水皰液、20份環(huán)境棉拭子樣本，經(jīng)檢測(cè)羊口蹄疫病毒核酸均為陰性，具體結(jié)果見圖2。說(shuō)明該病羊表現(xiàn)出的臨床癥狀不是羊口蹄疫毒引起的，應(yīng)結(jié)合羊口瘡病毒進(jìn)行鑒別。羊感染口蹄疫病毒后，一旦出現(xiàn)水皰結(jié)痂，病羊體溫會(huì)在短時(shí)間內(nèi)升高，初期體溫可達(dá)40～41℃，精神沉郁，食欲減退或拒食，脈搏和呼吸加快?？谇弧⑻愫腿榉康炔课怀霈F(xiàn)水皰、潰瘍和糜爛。

圖2 通用型口蹄疫病毒核酸熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 羊口瘡病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

共采集25份病原學(xué)樣本，其中3份水皰皮、2份水皰液、20份環(huán)境棉拭子樣本，經(jīng)檢測(cè)5份組織樣本羊口瘡病毒核酸均為陽(yáng)性，20份環(huán)境棉拭子樣本中均未檢測(cè)到羊口瘡病毒，具體結(jié)果見圖3。從檢測(cè)結(jié)果可以看出，該羊確實(shí)感染了羊口瘡病毒，但暫未對(duì)圈舍環(huán)境造成污染，此時(shí)應(yīng)盡早予以隔離并實(shí)時(shí)觀察，將健康羊只從該圈舍移除，并對(duì)圈舍進(jìn)行整體消毒。

圖3 羊口瘡病毒核酸熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本文采用分子生物學(xué)方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷的手段對(duì)羊痘、羊口瘡及羊口蹄疫三種病毒進(jìn)行鑒別[7，8]，最終確診為羊口瘡病毒。雖然在圈舍環(huán)境中未檢測(cè)到羊口瘡病毒，但建議該養(yǎng)殖戶首先應(yīng)第一時(shí)間隔離病羊，將同群其他健康羊只移出該發(fā)病圈舍，并對(duì)圈舍進(jìn)行全面徹底地消毒。消毒劑可選用含有效氯制劑、含有效溴消毒劑及強(qiáng)堿消毒劑，如二溴海因、葵甲溴氨、84消毒液等消毒，全面噴灑或浸泡飲水槽、采食槽等有可能被病羊污染的器具。將隔離病羊的排泄物進(jìn)行集中消毒，尿液及其他液體污染物可采用生石灰、二溴海因進(jìn)行浸泡1～2h消毒，糞便及其他固體可采用葵甲溴氨、84消毒液等噴灑消毒，作用30min以上。