荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖、凋亡及前體脂肪細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的影響*

吳冬梅,張曉東

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)以持續(xù)無(wú)排卵、高雄激素含量和胰島素抵抗為特征[1-3]。PCOS患者主要表現(xiàn)為胰島素抵抗(insulin resistance,IR) 和代償性高胰島素血癥，是引起月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)和不孕的常見(jiàn)原因之一，還與其他心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。遺傳因素、下丘腦-垂體-性腺軸功能失調(diào)、卵巢及腎上腺功能異常、胰島素抵抗、肥胖[6]都與PCOS的發(fā)病有聯(lián)系。脂肪組織是人體重要的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，是觸發(fā)胰島素抵抗炎癥反應(yīng)的重要場(chǎng)所，脂肪組織分泌功能紊亂在IR中扮演了重要的角色。荷葉是一種被廣泛研究的植物化學(xué)物，但其對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響，以及相關(guān)機(jī)制仍不明確。本研究檢測(cè)荷葉對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的影響，以期從分子生物學(xué)角度闡述荷葉降脂的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

荷葉，購(gòu)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，水煮提取，高壓滅菌，制備中藥水溶性提取物(extracts of Chinese medical herbs,ECMH)，4 ℃?zhèn)溆?。DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，批號(hào)12100046；胰蛋白酶(批號(hào)20160302)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，批號(hào)20150120)，均為北京Solarbio公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR Mix(批號(hào)A25741)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)18090050)，均為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；TRIZOL試劑，美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品，批號(hào)15596026；胰島素(批號(hào)I0516)、地塞米松(DEX，批號(hào)D4902)、 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，批號(hào)17018)、油紅O(批號(hào)O0625)，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Costar公司產(chǎn)品，批號(hào)3516；OLYMPUS CK40 倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Herseus公司產(chǎn)品；ABI7300熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水儀，美國(guó)Milipore公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

3T3-L1細(xì)胞，購(gòu)自上海細(xì)胞所。將 3T3-L1細(xì)胞在含有100 IU/L青霉素100 mg/L鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。生長(zhǎng)至90%傳代培養(yǎng)。取傳代2～3代后的細(xì)胞進(jìn)行種板并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測(cè)。細(xì)胞以1×105/mL密度接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h至生長(zhǎng)融合后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷葉水提物組。正常對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)；荷葉水提物各組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷葉水提物分別刺激3T3-L1前體脂肪細(xì)胞24 h，再更換含5 g/L MTT液無(wú)血清培養(yǎng)基90 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度。

1.3.2 荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞白介素-6(IL-6)信使核糖核酸(mRNA)、腫瘤壞死因子(TNF-α)mRNA的表達(dá)

采用熒光定量PCR檢測(cè)。將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，融合達(dá)到90%后隨機(jī)分2組。荷葉組：加入5 mL含1g/L的荷葉提取物。正常對(duì)照組：加入5 mL 普通培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，處理結(jié)束后提取RNA；誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)至第9天時(shí)按以上方法分組并加藥，培養(yǎng)24 h后清洗細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。所得各組RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性90 s；進(jìn)入PCR循環(huán)，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，從65 ℃緩慢加熱到95 ℃，以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)，每個(gè)標(biāo)本均設(shè)置復(fù)管PCR反應(yīng)。以GADPH為內(nèi)部對(duì)照，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各組基因表達(dá)得出RQ 值進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響

采用DAPI染色法檢測(cè)。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，染色后用熒光顯微鏡觀(guān)察。正常的細(xì)胞核呈亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞質(zhì)無(wú)熒光。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染。方法如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，接種到預(yù)先放置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為50 mL/L CO2的孵箱中培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行分組。正常組：加入5 mL 含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組：加入5 mL含1 g/L的荷葉提取物。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出蓋玻片，PBS漂洗2次;加入DAPI飽和工作液60 μL ，室溫避光作用10 min；PBS溶液洗滌3次，5 min/次；封片,在熒光顯微鏡下觀(guān)察并照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

見(jiàn)表1。各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的荷葉提取物均可不同程度地抑制細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)量-效關(guān)系。與正常對(duì)照組對(duì)比,各荷葉提取物組的OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合10 g/L的荷葉水提物組出現(xiàn)皺縮、脫壁、細(xì)胞脫落現(xiàn)象，決定取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/L的荷葉水提物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)荷葉水提對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

2.2 荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞 TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 g/L的荷葉水提物能降低3T3-L1前體脂肪細(xì)胞IL-6 mRNA 表達(dá)，能增高3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá) ，與正常對(duì)照組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 荷葉水提物對(duì)前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞 TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

2.3 荷葉水提物對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡的影響

見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組細(xì)胞在細(xì)胞核處發(fā)散微弱熒光，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 g/L的荷葉水提物組可見(jiàn)細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核縮小、發(fā)散高亮熒光；細(xì)胞漿中可見(jiàn)局部稀疏亮點(diǎn)(線(xiàn)粒體DNA)。早期凋亡的細(xì)胞有明亮凋亡熒光。

A.正常對(duì)照組

B.1 g/L荷葉水提物組

3 討 論

多囊卵巢綜合征患者存在代謝異常，主要表現(xiàn)為肥胖、胰島素抵抗、糖耐量損害和血脂異常等。PCOS的高雄激素血癥及高胰島素可改變脂蛋白及膽固醇的代謝而產(chǎn)生高脂血癥，加重脂類(lèi)代謝的異常，進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[10]。脂肪組織在人體中是一個(gè)重要的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，脂肪蓄積過(guò)多可能導(dǎo)致胰島素抵抗。肥胖癥與糖尿病、冠心病、高血壓、脂代謝紊亂及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重影響著人們的身心健康。脂肪組織的變化是肥胖癥發(fā)生的根本原因，脂肪組織能分泌一些特異性蛋白，在機(jī)體糖脂代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用，此成為治療肥胖癥的新靶點(diǎn)。IL-6是多功能炎性細(xì)胞因子,具有致炎和抗炎的雙向功能，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。其作用與組織中的含量有關(guān),正常水平的白介素對(duì)機(jī)體有利,過(guò)多則會(huì)引起炎性損害。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的ECMH可不同程度抑制脂肪細(xì)胞的增殖，隨著藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與正常對(duì)照組對(duì)比，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的荷葉水提物都可以不同程度抑制細(xì)胞增殖，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，對(duì)脂肪細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。但荷葉水提物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，會(huì)使脫落細(xì)胞增多，因此實(shí)驗(yàn)中選取1 g/L的ECMH進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR結(jié)果顯示：1g/L的荷葉水提物能降低3T3-L1前體細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)，增高成熟脂肪細(xì)胞TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)。DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：荷葉水提物可以顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞的凋亡。