一株長白山野生樺褐孔菌菌株的分離及菌絲生長特性研究

王麗瑩，王歡，王淑敏，陳長寶，張?jiān)溃泼?/p>

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春130117）

樺褐孔菌〔Inonotus obliquus（Ach.ex Pers.）Pilát〕，學(xué)名斜生纖孔菌，屬擔(dān)子菌門，銹革孔菌科，褐臥孔菌屬（纖孔菌屬）真菌[1]，夏秋季生于白樺、銀樺、榆樹和赤楊等活立木或倒木上，又稱為白樺茸、茶卡（h）、Birch mushroom等[2]。主要分布于俄羅斯、中國、日本、波蘭和荷蘭等國家，成為俄羅斯著名的抗腫瘤藥物。關(guān)禹樺褐孔菌研究較為廣泛，證實(shí)其含有多糖、三萜類、甾體、多酚等多種有效成分，具有抗糖尿病、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、降血脂、提高免疫力、保肝等多種生物活性及藥理作用[3-7]。

野生樺褐孔菌其生長十分緩慢，而人工栽培技術(shù)尚不成熟，加之大規(guī)模的采集導(dǎo)致野生匱乏，價格昂貴，且質(zhì)量參差不齊[8-10]，樺褐孔菌的利用受到極大的限制。因此，利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)獲得大量菌絲體，具有生產(chǎn)周期短，成本低，發(fā)酵物有效成分含量穩(wěn)定、可控等優(yōu)點(diǎn)[11]。固體或液體發(fā)酵技術(shù)可快速、大量獲得質(zhì)量均一且穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)物，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供廣闊的空間，但不同菌株之間菌絲活力差異較大，次級代謝產(chǎn)物多變，因此對野生菌株的生物學(xué)特性研究具有重要意義。本研究對一株采自長白山的野生樺褐孔菌純菌株的生長特性進(jìn)行研究，以菌絲生物量為考察指標(biāo)，優(yōu)化樺褐孔菌的最適培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，為后續(xù)液體和固體發(fā)酵工藝及對發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量評價等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樺褐孔菌采自長白山，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為多孔菌科，褐臥孔菌屬，樺褐孔菌（Inonotus obliquus），菌株編號：CCUCM-IO001，保存于吉林生菌物藥生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑

AUY220分析天平（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；TGL16高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；LDZX-50KBS高壓滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；pH B-5便攜式pH計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）；303AB-2恒溫培養(yǎng)箱（上海申光儀器儀表有限公司）。

蔗糖、葡萄糖（北京化工廠）；瓊脂粉、乳糖、CaO、木糖、MgSO4、CaCO3、(NH4)2SO4（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；蛋白胨、酵母粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；脲（廣東汕頭市西隴化工廠）；NH4NO3（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；KH2PO4（西攏化工股份有限公司）；VB1（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；豆餅粉、麥麩、玉米粉（安徽農(nóng)家有機(jī)食品）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樺褐孔菌純培養(yǎng)菌株的分離純化樺褐孔菌菌核表面消毒，切取菌核內(nèi)部約0.5 cm3的小塊，迅速接種到PDA培養(yǎng)基中（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然），置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌絲的萌發(fā)和長勢。選取菌絲粗壯濃密、無雜菌污染的菌落，接種于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，分離出純菌株，并進(jìn)行菌絲形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2 .1不同碳源對菌絲生長的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方（馬鈴薯20%，KH2SO4 0.15%，MgSO4 0.1%，瓊脂2%，pH自然）上，分別添加不同碳源，制成不同碳源培養(yǎng)基（C0：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；C1：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+蔗糖2%；C2：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+麥芽糖2%；C3：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+玉米面浸出液4%；C4：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+葡萄糖2%；C5：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+木糖2%；C6：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+乳糖2%），接種菌絲后，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 .2不同氮源對菌絲生長的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方（馬鈴薯20%，蔗糖2%，KH2SO4 0.15%，MgSO4 0.1%，瓊脂2%，pH自然）上，分別添加不同氮源，制成不同氮源培養(yǎng)基（N0：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；N1：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+蛋白胨2%；N2：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+硝酸銨0.2%；N3：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+硫酸銨0.2%；N4：基礎(chǔ)培養(yǎng)+基麥麩汁4%；N5：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+豆餅粉2%；N6：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+酵母粉2%；N7：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+尿素0.2%），接種菌絲后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 .3不同微量元素對菌絲生長的影響基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方（馬鈴薯20%，蔗糖2%，蛋白胨2%，瓊脂2%，pH自然）上，分別添加不同微量元素（W0：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；W1：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+MgSO4 0.1%+KH2PO4 0.15%；W2：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+KH2PO4 0.15%；W3：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NaH2PO4 0.15%；W4：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+MgSO4 0.15%；W5：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+VB10.05%；W6：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+CaO 0.1%），置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 正交試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方（馬鈴薯20%，瓊脂2%，pH自然），根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按L9（34）設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基配方，正交因子水平設(shè)計(jì)見表1。

表1正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor and level of the orthogonal test %

1.3.4 不同pH對菌絲生長的影響將基礎(chǔ)培養(yǎng)基（馬鈴薯汁20%、蔗糖1%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.10%、瓊脂2%）pH值分別調(diào)整為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，分別接種菌絲，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.5 不同溫度對菌絲生長的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（馬鈴薯20%、蔗糖1%、蛋白胨1%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.10%、瓊脂2%、pH自然）上接種接種菌絲，分別置于溫度為15、20、25、30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源對樺褐孔菌菌絲生長的影響由表2可知，樺褐孔菌在6種碳源上均能生長，但乳糖不宜作為碳源，菌絲生長極其緩慢，蔗糖作為碳源，菌絲生長速度最快，且菌絲生長勢良好，麥芽糖次之，而其他4種碳源菌絲生長速度相差不大。

表2不同碳源對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 2 Effects of different carbon sources on the mycelial growth of

表2不同碳源對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 2 Effects of different carbon sources on the mycelial growth of

碳源Carbon source菌絲形態(tài)Mycelial morphology生長勢Growth potential菌落邊緣Colony edge霉菌污染Mould contamination生長速度（cm2/d）Growth rate C0 粗、菌落厚度一般thick,generally thick colony C1 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony C2 粗、菌落薄thick,thin colony C3 粗、菌落薄thick,thin colony C4 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony C5 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony C6 細(xì)、菌落薄thin,thin colony旺盛strong較旺盛relatively strong一般general一般general旺盛strong旺盛strong不旺盛lack of growth整齊neat較整齊relatively neat整齊neat整齊neat較整齊relatively neat整齊neat整齊neat無污染non-pollution 0.723無污染non-pollution 1.003無污染non-pollution 0.874無污染non-pollution 0.797無污染non-pollution 0.767無污染non-pollution 0.712無污染non-pollution 0.179

2.1.2 不同氮源對樺褐孔菌菌絲生長的影響由表3可知，樺褐孔菌在7種氮源上均能生長，各組菌絲生長速度表現(xiàn)為：N1＞N2＞N3＞N0＞N4＞N5＞N6＞N7。蛋白胨、硝酸銨作為氮源，菌絲生長速度快，且菌絲生長勢良好，可作為其生長的良好氮源。但尿素組菌絲生長極其緩慢，不宜作為氮源。

表3不同氮源對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth of

表3不同氮源對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth of

氮源Nitrogen source菌絲形態(tài)Mycelial morphology生長勢Growth potential菌落邊緣Colony edge霉菌污染Mould contamination生長速度（cm2/d）Growth rate N0 粗、菌落薄thick,thin colony N1 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony N2 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony N3 粗、菌落一般thick,generally thick colony N4 細(xì)、菌落薄thin,thin colony N5 細(xì)、菌落薄thin,thin colony N6 粗、菌落較薄thin,relatively thin colony N7 細(xì)、菌落薄thin,thin colony旺盛strong較旺盛relatively strong較旺盛relatively strong旺盛strong一般general一般general一般general不旺盛lack of growth較整齊relatively neat較整齊relatively neat較整齊relatively neat較整齊relatively neat較整齊relatively neat較整齊relatively neat較整齊relatively neat整齊neat無污染non-pollution 1.066無污染non-pollution 1.119無污染non-pollution 1.118無污染non-pollution 1.071無污染non-pollution 1.049無污染non-pollution 0.870無污染non-pollution 0.665無污染non-pollution 0.117

2.1.3不同微量元素對樺褐孔菌菌絲生長的影響由表4可知，6種微量元素添加后，樺褐孔菌除在添加0.1% CaO菌絲不能生長外，添加其他微量元素均能生長，各組微量元素菌絲生長速度表現(xiàn)為：W1＞W(wǎng)2＞W(wǎng)3＞W(wǎng)0＞W(wǎng)4＞W(wǎng)5。其中，0.1%MgSO4+0.15%KH2PO4作為微量元素，菌絲生長速度快，且菌絲生長勢最好。

表4不同微量元素對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 4 Effects of different microelements on the mycelial growth of

表4不同微量元素對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 4 Effects of different microelements on the mycelial growth of

微量元素Microelement生長速度（cm2/d）Growth rate W0 粗、菌落厚thick,thick colony菌絲形態(tài)Mycelial morphology生長勢Growth potential菌落邊緣Colony edge霉菌污染Mould contamination旺盛strong整齊neat無污染non-pollution 0.918 W1 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony W2 粗、菌落一般thick,generally thick colony W3 粗、菌落厚thick,thick colony W4 粗、菌落厚thick,thick colony W5 粗、菌落薄thick,thin colony W6 基本不生長grow poorly較旺盛relatively strong旺盛strong旺盛strong旺盛strong旺盛strong不旺盛lack of growth整齊neat整齊neat整齊neat整齊neat整齊neat整齊neat無污染non-pollution 1.167無污染non-pollution 1.021無污染non-pollution 1.002無污染non-pollution 0.925無污染non-pollution 0.800無污染non-pollution 0.000

2.2 正交試驗(yàn)

由表5、6可知，4個考察因子中對菌絲生長影響最大的為蔗糖，其次為MgSO4，再次為蛋白胨，影響最小的為KH2PO4。最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖1%、蛋白胨1%、MgSO40.15%、KH2PO40.10%。由于正交試驗(yàn)7培養(yǎng)基配方比例與方差分析得到的培養(yǎng)基配方比例不同，所以對這2種不同配方比例的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為蔗糖1%、蛋白胨1%、MgSO4 0.1%、KH2PO4 0.15%菌絲生長情況較好。

表5正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results

表6方差分析Table 6 Analysis of various

2.3 不同pH對樺褐孔菌菌絲生長的影響

由表7可知，樺褐孔菌菌絲在pH值為4.5~7.5均可生長，其菌絲生長速率表現(xiàn)為：pH值為6.5＞7＞4.5＞6.0＞5.0＞7.5＞5.5，因此,其最適宜pH值為6.5，表明該菌株適于在弱酸性至中性環(huán)境中生長。

表7 pH對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 7 Effects of pH on the mycelial growth of

表7 pH對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 7 Effects of pH on the mycelial growth of

pH 菌絲形態(tài)Mycelial morphology生長勢Growth potential菌落邊緣Colony edge霉菌污染Mould contamination生長速度（cm2/d）Growth rate 4.5 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony 5.0 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony 5.5 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony 6.0 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony 6.5 較粗、菌落較厚relatively thick,relatively thick colony 7.0 粗、菌落厚thick,thick colony 7.5 細(xì)、菌落薄thin,thin colony較旺盛relatively strong 整齊neat 無污染non-pollution 1.128較旺盛relatively strong 整齊neat 無污染non-pollution 1.102旺盛strong 整齊neat 無污染non-pollution 0.783較旺盛relatively strong 整齊neat 無污染non-pollution 1.126較旺盛relatively strong 整齊neat 無污染non-pollution 1.232一般general 整齊neat 無污染non-pollution 1.192一般general 整齊neat 無污染non-pollution 0.876

2.4 不同溫度對樺褐孔菌菌絲生長的影響

由表8可知，溫度對菌絲生長影響較大，樺褐孔菌菌絲在15~30℃均可生長，但不適合在15~20℃下培養(yǎng)，菌絲體生長較慢，最適生長溫度為30℃，菌絲生長速度最快，菌絲長勢最強(qiáng)。

表8不同溫度對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 8 Effects of different temperatures on the mycelial growth of

表8不同溫度對樺褐孔菌菌絲生長的影響Table 8 Effects of different temperatures on the mycelial growth of

溫度（℃）Temperature 菌絲形態(tài)Mycelial morphology生長情況Growth situation生長勢Growth potential菌落邊緣Colony edge霉菌污染Mould contamination生長速度（cm2/d）Growth rate 15 細(xì)、菌落薄thin,thin colony 20 較細(xì)、菌落厚relatively thin,thick colony 25 較粗、菌落厚relatively thick,thick colony 30 較粗、菌落厚relatively thick,thick colony不旺盛lack of growth旺盛strong較旺盛relatively strong較旺盛relatively strong整齊neat整齊neat整齊neat整齊neat無污染non-pollution 0.46無污染non-pollution 0.57無污染non-pollution 1.33無污染non-pollution 2.01

3 結(jié)論與討論

樺褐孔菌子實(shí)體呈瘤狀，通常是以菌核形式生長于樺樹皮下或活立木的樹皮下或倒木上[12]，由于樺褐孔菌具有顯著的抗糖尿病和抗腫瘤活性而受到多個國家科研工作者的歡迎，在俄羅斯、日本和中國被廣泛使用。由于其生長周期極長、資源稀缺等多種因素，難以大量獲得樺褐孔菌子實(shí)體，且價格昂貴。因此，應(yīng)用發(fā)酵微生物技術(shù)獲得樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物，以菌絲體、發(fā)酵液代替子實(shí)體，能快速獲得其發(fā)酵產(chǎn)物，不僅便于對發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量控制和藥理活性方面的研究，同時具有生產(chǎn)周期短、易獲得和成本低等特點(diǎn)，在食品和藥品行業(yè)的應(yīng)用具有巨大的潛力。

由于不同樺褐孔菌菌株生長特性不同，故本研究對采自長白山的一株野生樺褐孔菌進(jìn)行分離純化，得到純培養(yǎng)菌株CCUCM-IO001，并對菌絲生長特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了其菌絲體培養(yǎng)基配方為蔗糖1%、蛋白胨1%、MgSO4 0.1%、KH2PO4 0.15%，溫度30℃，pH 6.5，此條件下菌絲的生長情況最好，為以后優(yōu)化樺褐孔菌液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)，規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供一定指導(dǎo)，為后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)物的藥理活性研究，功能食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。而其發(fā)酵產(chǎn)物與子實(shí)體的活性成分含量差異，相關(guān)藥理活性比較研究仍需進(jìn)一步深入研究。