藜麥莖段組培快繁體系的建立

段鵬慧 ，李小艷 ，焦 茹 ，鄧 妍 ，王創(chuàng)云

（1.山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原030009；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld）別名南美藜、奎藜、奎奴亞藜，屬1 年生藜科雙子葉植物，原產(chǎn)于南美洲，是印加人的主要糧食作物，被稱為“糧食之母”。藜麥蛋白含量高于普通谷物，尤其富含人體必需的氨基酸、礦質(zhì)營養(yǎng)、維生素E、類黃酮等生物活性物質(zhì)[1-2]，營養(yǎng)豐富。目前，藜麥在美國、日本、歐洲等地開發(fā)利用前景較高[3]。

藜麥?zhǔn)俏覈M(jìn)的新型農(nóng)作物，近年來，在我國甘肅、山西、青海、河北、吉林等地已開展了大面積的栽培生產(chǎn)[4-5]，在藜麥化學(xué)組成、營養(yǎng)成分、種質(zhì)資源、栽培技術(shù)等方面也進(jìn)行了一系列基礎(chǔ)研究工作，育種工作尚處于初級(jí)階段。藜麥為異源四倍體（2n＝4x＝36）[6]，自然異交率為 10%～17%，群體的基因組成多為雜合型，遺傳不穩(wěn)定。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)能夠保持母本的遺傳性狀，解決藜麥優(yōu)良品種有性繁殖性狀分離的問題。俞涵譯等[7]研究了藜麥莖段愈傷組織的誘導(dǎo)及優(yōu)化體系；曹寧等[8]研究了藜麥莖段愈傷組織分化和不定芽增殖。目前，國內(nèi)有關(guān)藜麥組培快繁的研究報(bào)道相對(duì)較少。

本試驗(yàn)以藜麥帶腋芽莖段為外植體，針對(duì)腋芽誘導(dǎo)、不定芽增殖、生根和移栽的影響因素進(jìn)行研究，以期深入探索藜麥再生組培與快繁體系的建立，為生產(chǎn)中短期內(nèi)快速繁殖優(yōu)質(zhì)藜麥種苗提供一定技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藜麥材料為HQ1，由山西華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供。以藜麥幼苗期生長健壯、無病蟲害的植株為母本，切取直徑0.3～0.7 cm 莖段作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的準(zhǔn)備與消毒 將外植體材料去除葉片，用軟毛筆蘸取飽和洗衣粉水將其清洗干凈，然后流水沖洗30 min，剪成長度為1.5～2.0 cm 的帶腋芽莖段（腋芽上下至少保留0.5～1.0 cm）；然后，在超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2進(jìn)行常規(guī)消毒處理 3、5、7、9、11、13 min，隨后用無菌水漂洗6 次，每次3 min；后立刻接種于MS 基本培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種30 瓶，每瓶1 個(gè)外植體。接種后7～10 d 統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、成活率及死亡率，分析0.1%HgCl2不同消毒時(shí)間處理的效果。

1.2.2 誘導(dǎo)腋芽萌發(fā) 將生長狀態(tài)良好的無菌單芽莖段接種至MS 附加有不同濃度細(xì)胞分裂素6-BA、生長素NAA 的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表1），研究6-BA 和NAA 對(duì)藜麥腋芽萌發(fā)的影響，以篩選適宜的初代培養(yǎng)基。每處理10 瓶，每瓶2 株，重復(fù)3 次。接種7 d 后觀察腋芽萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌芽率。

表1 激素配方篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將腋芽萌發(fā)的初代苗切成帶1～2 個(gè)葉片的莖段，接種于增殖培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基以 MS＋NAA 0.2 mg/L 為對(duì)照（CK），添加質(zhì)量濃度分別為 0.5、1.0、2.0 mg/L 的細(xì)胞分裂素 6-BA 和KT，共設(shè)6 個(gè)處理，即A.6-BA 0.5 mg/L；B.6-BA 1.0 mg/L；C. 6-BA 1.5 mg/L；D. KT 0.5 mg/L；E. KT 1.0 mg/L；F.KT1.5 mg/L，以探究不同激素不同濃度對(duì)不定芽增殖的影響。每處理10 瓶，每瓶3 株。15 d后，觀察增殖情況，并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.4 生根誘導(dǎo) 將高度為3～5 cm 的健壯芽苗轉(zhuǎn)接至1/2 MS 附加不同質(zhì)量濃度生長素IBA（0、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0 mg/L）的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。每處理10 瓶，每瓶3 株。15 d 后觀察生根情況，并統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.5 馴化移栽 選擇根長2～4 cm、株高5 cm 以上、長勢健壯、根系良好的藜麥生根組培苗，溫室中煉苗7～14 d；然后洗凈根部培養(yǎng)基，迅速移栽至已充分消毒的基質(zhì)中，基質(zhì)設(shè)置5 種處理，分別是河沙、草炭土、蛭石、蛭石+草炭土體積比為3∶1 和蛭石＋草炭土體積比為2∶1。每處理10 瓶，每瓶3 株。移栽后置于通風(fēng)、散光環(huán)境中養(yǎng)護(hù)，保持溫度20～23 ℃、空氣濕度80%～100%。20 d 后統(tǒng)計(jì)成活率并觀察生長狀況。

1.2.6 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基附加蔗糖30 g/L、瓊脂 8 g/L，pH 值 5.8；培養(yǎng)溫度（20±2）℃，空氣濕度70%～80%，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間13 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003 和SPSS 19 軟件進(jìn)行Duncan 檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)藜麥莖段消毒的影響

接種3 d 后，部分處理外植體材料不同程度出現(xiàn)黏液狀菌落，且隨時(shí)間的延長，污染數(shù)量逐漸增多，菌斑面積擴(kuò)大；15～25 d，污染數(shù)量不再上升；但是接種 7 d 后，9、11、13 min 消毒處理的少量外植體材料顏色由綠轉(zhuǎn)黃，繼而變?yōu)楹稚⒑谏?，最后枯死?/p>

由表2 可知，酒精消毒時(shí)間保持不變時(shí)，隨著HgCl2處理時(shí)間的增加，外植體污染率逐漸降低，其中，HgCl2處理3 min 的污染率最高，達(dá)43.3%，且與其他5 個(gè)處理間差異顯著；HgCl2處理13 min 污染率為0，但死亡率最高，為33.3%，且與其他各處理間的差異達(dá)顯著水平；HgCl2消毒處理9 min 成活率最高，為83.3%，但與HgCl2消毒處理7、11 min間差異不顯著，與另外3 個(gè)處理間差異顯著。選擇成活率最高的處理即75%酒精30 s＋0.1% HgCl29 min 作為藜麥腋芽最佳的滅菌方案。

表2 不同消毒處理對(duì)外植體的影響

2.2 不同激素及濃度對(duì)藜麥腋芽萌發(fā)的影響

培養(yǎng)8～10 d，各個(gè)處理腋芽開始膨大，出現(xiàn)淡綠色圓突狀芽點(diǎn)；25 d 后芽點(diǎn)陸續(xù)萌發(fā)展葉，多數(shù)腋芽萌發(fā)的嫩莖長4～7 mm；30 d 后芽可長至10～23 mm，基部直徑3～5 mm。從表3 可以看出，處理7（培養(yǎng)基為 6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L）的萌芽率最高，達(dá)90%，該處理下，發(fā)芽最快，芽飽滿且長勢好。

方差分析結(jié)果表明（表 4），6-BA、NAA 及二者的交互作用對(duì)藜麥腋芽萌發(fā)均有顯著影響，F(xiàn)值由大到小依次為 261.083（6-BA）、28.583（NAA）和5.958（二者的交互作用），說明6-BA 對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響最大，NAA 次之，二者的交互作用最小。

表3 不同激素誘導(dǎo)藜麥腋芽的萌發(fā)情況

表4 不同濃度6-BA 和NAA 組合腋芽萌芽率的方差分析

為進(jìn)一步探明不同因素各水平間的差異情況，采用新復(fù)極差法（Duncan）進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明（表 5），6-BA 不同水平中，1.5 mg/L 的萌芽率最高，且相對(duì)于1.0、0.5 mg/L 對(duì)藜麥腋芽萌發(fā)明顯提高，并達(dá)到差異顯著水平；NAA 不同水平中，0.5 mg/L的萌芽率最高，且與1.0、0.1 mg/L 間差異達(dá)顯著水平，說明 1.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA 對(duì)藜麥腋芽萌發(fā)作用較強(qiáng)。

表5 6-BA、NAA 各水平的差異顯著性分析

綜上，確定藜麥腋芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L。

2.3 不同激素及濃度對(duì)不定芽增殖的影響

培養(yǎng)13 d 后，無菌莖段開始出現(xiàn)新芽；25 d 左右多數(shù)處理的不定芽數(shù)量逐漸增多，生長狀況不一；繼續(xù)培養(yǎng)，部分不定芽陸續(xù)抽出莖、葉。

由圖1 可知，添加激素的培養(yǎng)基中，不定芽增殖系數(shù)至少是對(duì)照（0.6）的3 倍以上，且差異均達(dá)顯著水平；同一種激素隨著濃度的增加，不定芽增殖系數(shù)呈逐漸上升趨勢，但1.0、2.0 mg/L 這2 個(gè)梯度間差異不顯著，二者較0.5 mg/L 梯度差異均顯著；6-BA 較 KT作用明顯，1.0、2.0 mg/L 6-BA 的不定芽增殖系數(shù)顯著高于同一梯度KT 的增殖系數(shù)；6-BA質(zhì)量濃度上升至2.0 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)最高，為4.9，但是芽苗纖弱、葉片小，長勢較弱。因此，MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 是最適宜的增殖培養(yǎng)基。

2.4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)藜麥芽苗生根的影響

培養(yǎng)15 d 左右，陸續(xù)可見從試管苗基部分化出少量白色不定根；約25 d 后，分化較早的不定根又產(chǎn)生須根，根長約2～5 cm。從表6 可以看出，生長素為0 mg/L（CK）時(shí)，試管苗生根率僅為16.7%，不定根數(shù)量較少，生根慢，且與其他處理的差異達(dá)到顯著水平；同一濃度水平的IBA，單獨(dú)使用與IBA和NAA 配合使用相比，生根率差異不顯著；同一濃度水平的NAA，NAA 和IBA 配合使用的生根率顯著高于NAA 單獨(dú)使用；生根率隨著IBA 濃度增加而增加，即1.0 mg/L＞0.5 mg/L＞0。當(dāng)IBA為1.0 mg/L時(shí)有愈傷組織產(chǎn)生，不定根由愈傷組織發(fā)出，根易折；當(dāng) IBA 為 0.5 mg/L、NAA 為 0 時(shí)，生根率為 76.7%，但不定根數(shù)量多，根較粗壯，移栽成活率較高。綜合考慮生根率、不定根數(shù)量及根長等因素，確定藜麥適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)藜麥生根的影響

2.5 基質(zhì)類型對(duì)藜麥組培苗移栽的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖2），蛭石與草炭土混合基質(zhì)的移栽成活率、生長高度較河沙、草炭土、蛭石的效果明顯，且差異達(dá)顯著水平；蛭石＋草炭土體積比為3∶1 處理的組培苗成活率為93.3%、生長高度為2.86 cm，達(dá)到最佳效果，與蛭石＋草炭土體積比為2∶1 處理相比差異達(dá)顯著水平；草炭土的組培苗成活率最低，僅有58.3%；河沙的生長高度最小，為1.32 cm。因此，適合試管苗移栽的基質(zhì)為蛭石和草炭土體積比為3∶1。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的消毒

植物組織培養(yǎng)中，獲得無菌體系是組培成功的首要條件[9]。本研究以藜麥幼苗期帶腋芽莖段為外植體材料，采用75%酒精消毒處理30 s、0.1%的HgCl2不同時(shí)間梯度消毒，隨HgCl2消毒時(shí)間加長，污染率逐漸降低，消毒效果明顯；但過度消毒會(huì)加重外植體傷害程度，造成外植體失活死亡，腋芽啟動(dòng)受到影響。因此，綜合考慮消毒后外植體材料的成活情況，確定75%酒精消毒處理30 s、0.1%的HgCl2消毒處理9 min 是藜麥帶腋芽莖段的最佳消毒方案，該條件下，成活率達(dá)83.3%，長勢良好。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)藜麥組培的影響

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類與濃度是芽誘導(dǎo)、增殖及生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。細(xì)胞分裂素、生長素能明顯促進(jìn)腋芽啟動(dòng)與生長。有研究表明，6-BA 對(duì)不定芽誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，添加適量6-BA 有利于不定芽的形成[10-12]。生長素NAA 對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果并不是隨NAA濃度的升高而增強(qiáng)，與生長素特性有關(guān)[13]。在一定范圍內(nèi)，高濃度細(xì)胞分裂素6-BA 與低濃度生長素NAA 有利于芽的形成。本研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中 6-BA 為 1.5 mg/L、NAA 為 0.5 mg/L 時(shí)，藜麥誘導(dǎo)率最高，達(dá)90.0%，且芽萌發(fā)最快，芽體飽滿，色澤綠。

本研究表明，高濃度6-BA、KT 與低濃度NAA的激素組合的藜麥試管苗帶芽莖段的增殖系數(shù)較高。這與洪森榮等[14]在香果樹上的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。細(xì)胞分裂素對(duì)不定芽的增殖有促進(jìn)作用，其中，6-BA 的增殖作用較KT 好，這與孫駿威等[15]的研究結(jié)果一致。本研究表明，MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 增殖培養(yǎng)基中，藜麥不定芽增殖系數(shù)最高，為4.9，芽苗健壯，長勢良好。

大量研究表明，生長素在生根培養(yǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，不同種類、不同濃度生長素的誘導(dǎo)生根能力存在明顯差異[16-17]。本試驗(yàn)中，不添加生長素時(shí)，藜麥組培苗生根率僅有16.7%；單獨(dú)添加IBA、NAA及二者配合使用均能有效誘導(dǎo)藜麥組培苗產(chǎn)生不定根，但I(xiàn)BA 處理較NAA、IBA＋NAA 的生根率高，生根效果好，根粗壯；IBA 為1.0 mg/L 處理的生根率較IBA 為0.5 mg/L 處理高，但不定根發(fā)自愈傷組織，根易折，移栽后植株成活率降低[18-19]。因此，確定藜麥誘導(dǎo)不定根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L。

3.3 馴化移栽

馴化移栽是植物組織培養(yǎng)最為關(guān)鍵的階段，移栽基質(zhì)要求疏松、透氣、透水，有一定肥力[20]。本研究表明，藜麥組培苗在5 種不同移栽基質(zhì)中的成活率、生長情況差異明顯。蛭石∶草炭土體積比為3∶1 時(shí)，移栽成活率可達(dá)93.3%、生長高度為2.86 cm，原因可能是由于草炭土營養(yǎng)豐富、保肥能力好，而蛭石透水透氣性強(qiáng)，二者比例恰當(dāng)，有利于藜麥幼苗生長。