骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡修復(fù)大鼠早發(fā)性卵巢功能不全的自噬機(jī)制

邱 婷 周 潔 翁廷松 林敏詩(shī)

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)科(廣州 510623)

早發(fā)性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency，POI)以卵泡的過(guò)早耗竭為特征，臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)和血清促性腺激素升高，嚴(yán)重危害女性的生育力及身心健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有l(wèi)%的女性40歲之前罹患該病，且有0.1%的患者發(fā)病時(shí)未滿(mǎn)30歲[1]。最近的研究報(bào)道，約有2.8%的中國(guó)女性患有POI[2]。歐洲人類(lèi)生殖與胚胎學(xué)會(huì)(ESHRE)推薦的POI診斷標(biāo)準(zhǔn)為：閉經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)至少4個(gè)月和兩次檢測(cè)血清卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平>25 U/L(間隔4周)[3]。目前POI的治療方式有激素治療和免疫治療等方法恢復(fù)卵巢功能，但是這些治療方法不能促進(jìn)自身卵巢組織再生修復(fù)。目前國(guó)內(nèi)外試圖采用干細(xì)胞來(lái)治療卵巢早衰，為POI的治療提供新的途徑[4]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一群來(lái)源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs除了具備多系分化潛能之外，還具有免疫調(diào)節(jié)能力、抗纖維化、抗凋亡和促血管生成等作用，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞替代治療和再生醫(yī)學(xué)，其主要作用機(jī)制是通過(guò)干細(xì)胞旁分泌的有效成分起作用，比如微泡[5]。MSC廣泛存在于全身組織，包括骨髓、脂肪、胎盤(pán)，臍帶、羊水等。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的微泡(MSC-MV)是MSCs 在靜息或活化狀態(tài)下釋放到胞外的膜分泌體系，MSC-MV 內(nèi)含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA 及miRNA 等多種生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)組織形態(tài)學(xué)及功能學(xué)修復(fù)的作用。細(xì)胞自噬作為一個(gè)重要的細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制，參與了顆粒細(xì)胞生存能力和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的過(guò)程，并進(jìn)而影響卵泡發(fā)育和卵巢功能。已有研究表明，自噬的誘導(dǎo)和調(diào)控與顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，并介導(dǎo)了卵泡的閉鎖[6]。本研究將應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡治療大鼠早發(fā)卵巢功能不全，治療后28 d檢測(cè)卵巢功能及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況，明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡修復(fù)大鼠早發(fā)卵巢功能不全的自噬機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雌性大鼠(8周齡)32只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體質(zhì)量范圍173～225 g，平均(205. 03±12. 63) g，由廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。SD 大鼠飼養(yǎng)時(shí)控制實(shí)驗(yàn)室恒溫(20±2)℃，恒濕50%～60%，SD 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食，飲水，光照12 h，建模前12 h 禁食，試驗(yàn)均通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。2 只大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備，10只大鼠為正常對(duì)照組，20 只大鼠用于早發(fā)卵巢功能不全模型制備。順鉑購(gòu)自默克公司(貨號(hào)P4394)，血清雌二醇(E2，貨號(hào)D741007)、卵泡刺激素(FSH，貨號(hào)D731057)、和抗苗勒管激素(AMH，貨號(hào)D711094)濃度的ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，自噬相關(guān)蛋白LC 3、P62、GAPDH抗體購(gòu)自abcam。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備 頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)用 SD 大鼠， 75% 酒精浸泡 60 s，取出后放置于消毒好的手術(shù)臺(tái)上， SD大鼠全身碘伏消毒后鋪無(wú)菌洞巾，分離皮膚、于髖關(guān)節(jié)離斷下肢剪除踝關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端， PBS緩沖溶液清洗3次，用5 mL注射器取適量完全培養(yǎng)液(12 mL/只)于無(wú)菌燒杯(50 mL)備用，咬骨鉗將剔除軟組織的骨干兩端達(dá)骨髓腔，用帶針頭注射器取上述完全培養(yǎng)液緩慢沖刷骨髓腔2～3次，無(wú)菌過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾即得干細(xì)胞，放入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)傳代。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡制備 將原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、傳代至第3代，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)平底后換用 DMEM 過(guò)夜(約 14h)培養(yǎng)。不含胎牛血清的 DMEM 原液可刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放MVs ；采用國(guó)際上公認(rèn)的差速離心法分離微泡，①差速離心：收集細(xì)胞培養(yǎng)液，300 g離心10 min，取上清，2000 g離心10 min，取上清，10 000 g離心30 min，取上清。②超高速離心：差速離心上清液液100 000 g離心70 min，一次傾倒離心管，去除上清液。③重懸、洗滌：各離心管分別加入PBS溶液100 μL，并移液槍反復(fù)吹打使MSC-MV重新溶解；溶解液體再次超高速離心， 100 000 g離心70 min，用上法傾倒上清，重新加入PBS溶液100 μL，反復(fù)吹打，收集于1 mL EP管，所得溶液即為MSC-MV重懸液；冰凍保存。

1.2.3 大鼠早發(fā)卵巢功能不全模型制備 模型對(duì)照組及微泡組腹腔注射順鉑溶液，第1 天注射 50 mg/kg，第2 天連續(xù)注射16 mg/kg 14 d。正常對(duì)照組注射等體積滅菌用水。

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡移植治療大鼠早發(fā)卵巢功能不全 大鼠卵巢功能不全大鼠建模成功后3 d，微泡組尾靜脈注射1 mL 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源微泡，干細(xì)胞組尾靜脈注射1 mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，模型對(duì)照組尾靜脈注射1 mL生理鹽水，正常對(duì)照組尾靜脈注射1 mL生理鹽水。

1.2.5 觀察指標(biāo)檢測(cè) ①細(xì)胞形態(tài)觀察。分離獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別在培養(yǎng)48 h、3 d、7 d后光鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。②卵巢功能測(cè)定。正常對(duì)照組及模型制備后3 d 尾靜脈采血，ELISA檢測(cè)血清FSH、E2 含量明確卵巢功能。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡移植后28 d ELISA檢測(cè)血清FSH、E2、AMH含量了解卵巢儲(chǔ)備功能。③自噬指標(biāo)檢測(cè)。移植后28 d三組分別取卵巢組織檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、P62，GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究全部數(shù)據(jù)用 SPSS 18 .0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)觀察

接種后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)48 h的培養(yǎng)后，光鏡下觀察示：滿(mǎn)視野圓形血細(xì)胞中間短梭狀細(xì)胞零星分布，(圖1-A)；接種72 h，光鏡觀察示：瓶底短梭狀細(xì)胞數(shù)量增加，呈集落聚集分布，細(xì)胞集落較前變大，(圖1-B)；接種第7日，光鏡觀察示：細(xì)胞集群明顯、相互交織，細(xì)胞呈長(zhǎng)條型，似紡錘(圖1-C)；接種第10日，光鏡觀察示：長(zhǎng)梭狀細(xì)胞滿(mǎn)視野，90%發(fā)生融合(圖1-D)。此時(shí)可以進(jìn)行傳代處理。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞下觀察(A:原代細(xì)胞48 h；B原代細(xì)胞接種72 h；C原代細(xì)胞接種7 d；D原代細(xì)胞接種10 d)

2.2 模型制備后3 d卵巢功能及儲(chǔ)備功能測(cè)定

模型制備組E2 含量低于正常對(duì)照組，模型制備組FSH含量高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 正常對(duì)照及模型制備后3 d E2及FSH水平

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡移植后28 d卵巢功能及儲(chǔ)備功能測(cè)定移植后28 d，三組E2 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，移植組E2含量高于模型對(duì)照組，三組FSH水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，移植組FSH含量低于模型對(duì)照組，三組AMH 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，移植組AMH 含量高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表2。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡移植后28 d卵巢組織自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)移植后28 d，卵巢組織自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)，與模型對(duì)照組相比，微泡移植組的LC3表達(dá)升高，P62表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 卵巢組織自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)圖A顯示的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡移植后28 d卵巢組織自噬相關(guān)蛋白LC3及P62的Western Blot 檢測(cè)條帶圖B為蛋白條帶灰度分析結(jié)果， *P<0.01， *P<0.01

3 討 論

自噬是指細(xì)胞通過(guò)各種途徑在自噬溶酶體內(nèi)自我消化、分解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等，是一種不依賴(lài)半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)的過(guò)程。基礎(chǔ)水平的自噬對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、發(fā)揮其生物學(xué)功能是必要的，細(xì)胞通過(guò)自噬維持自我穩(wěn)定，更好的適應(yīng)各種應(yīng)激，達(dá)到自我更新等[7]。細(xì)胞自噬作為一個(gè)重要的細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制，參與了顆粒細(xì)胞生存能力和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的過(guò)程，并進(jìn)而影響卵泡發(fā)育和卵巢功能，細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于正常卵巢功能的發(fā)揮至關(guān)重要，自噬缺陷可能會(huì)造成顆粒細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)或損傷應(yīng)激下穩(wěn)態(tài)維持的障礙，表現(xiàn)為一系列生物學(xué)行為的異常，顆粒細(xì)胞功能的失調(diào)損傷了正常卵巢功能的發(fā)揮，進(jìn)而參與了POI疾病的發(fā)生和進(jìn)展，有研究發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因與POI有關(guān)[8]。

表2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡移植后28 d卵巢功能及儲(chǔ)備功能 n=10

LC3及P62是自噬相關(guān)的兩個(gè)重要蛋白，LC3在細(xì)胞內(nèi)定位于自噬體膜，主要參與自噬體的形成，LC3在細(xì)胞內(nèi)主要存在兩種亞型：LC-I型和LC-II型，前者主要參與自噬相關(guān)蛋白的募集，后者在自噬的過(guò)程中始終定位于自噬體膜上，LC3常被作為自噬起始的標(biāo)記物，也被作為檢測(cè)自噬程度的分子標(biāo)記，研究中所測(cè)LC3水平均為L(zhǎng)C3-II[9]。P62蛋白是原癌基因C-Myc編碼，在細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞核，當(dāng)在參與自噬過(guò)程中，P62蛋白同樣需要先與細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)相結(jié)合，其后與LC3-II蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并最終在自噬溶酶體中降解，因?yàn)镻62蛋白隨著自噬的不斷進(jìn)行而降解，所以其表達(dá)水平與自噬水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[10]。

臨床工作中發(fā)現(xiàn)化療物如順鉑會(huì)對(duì)女性的卵巢造成不可逆的影響，基于此，本研究采用順鉑建立大鼠早發(fā)卵巢功能不全模型，模型制備后3 d，模型制備組E2 含量低于正常對(duì)照組(P<0.001)，F(xiàn)SH含量高于正常對(duì)照組(P<0.001)，提示POI大鼠模型制備成功。之后對(duì)順鉑建立的早發(fā)卵巢功能不全的大鼠模型進(jìn)行BMSC-MV尾靜脈注射移植治療，移植后28 d，MV移植組AMH及E2水平高于模型對(duì)照組(P<0.001)，提示微泡移植組大鼠的卵巢功能得到了改善，MV移植組FSH水平低于模型對(duì)照組(P<0.001)，提示BMSC-MV部分修復(fù)了早發(fā)卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能。進(jìn)一步對(duì)卵巢組織的自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后28 d，與模型對(duì)照組相比，微泡移植組的LC3表達(dá)水平升高，P62表達(dá)水平降低(P<0.001)，顯示微泡移植組的自噬活性較模型對(duì)照組有提高，明確了卵巢組織自噬在BMSC-MV部分修復(fù)早發(fā)卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能中的重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡可以修復(fù)順鉑所致的早發(fā)卵巢功能不全大鼠模型的卵巢功能，并且是通過(guò)自噬起作用。為將來(lái)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性微泡在POI臨床治療中的應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。