富油微藻分離鑒定技術(shù)研究進(jìn)展

王天強(qiáng)，周林宗，王紫荊，王江鵬，王子敬，張 偉，田海燕

（楚雄師范學(xué)院，云南 楚雄 675000）

隨著人類社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口數(shù)量的增多，能源需求量也愈來(lái)愈大。煤、石油、天然氣作為不可再生的化石能源，大部分已被開采。能源短缺、急切需要加快尋找綠色清潔能源的步伐。生物柴油是新型清潔能源，不會(huì)像化石燃料一樣面臨枯竭，且燃燒后對(duì)環(huán)境的污染小。目前世界各國(guó)把目光聚集在生物柴油的研發(fā)上，生物柴油勢(shì)必將成為新能源開發(fā)的新趨勢(shì)［1］。

生物柴油是通過(guò)動(dòng)物、植物體油脂等和醇類在酸或堿催化劑下反應(yīng)得到［2］。傳統(tǒng)油料作物因其產(chǎn)量低、成本高、與農(nóng)作物爭(zhēng)地、受季節(jié)性影響高等缺點(diǎn)不宜大規(guī)模應(yīng)用。微藻是一種生長(zhǎng)在自然水體和土壤中的單細(xì)胞生物，生長(zhǎng)迅速、繁殖快、可以利用污水內(nèi)成分生長(zhǎng)，是理想的生物柴油替代品［3］。

1 微藻研究發(fā)展歷程

直到目前為止，自從微藻生物能源概念的提出和發(fā)展，微藻已成為污水處理行業(yè)的熱門研究對(duì)象，在微藻工藝、設(shè)備、及機(jī)理方面已有許多成果。

1）微藻研究發(fā)展歷程。美國(guó)麻省理工學(xué)院的研究學(xué)者于1950年在校園內(nèi)建筑物的屋頂開始進(jìn)行養(yǎng)殖藻類生產(chǎn)生物燃料的試驗(yàn)，并在研究中第一次提到微藻生物能源概念；之后，Oswald等1957年提出了利用微藻來(lái)處理污水中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［4］，這為藻類應(yīng)用于污水處理奠定了基礎(chǔ)。Mcgriff等在1971年提出了“活性藻”的概念，顧名思義，把活性污泥和藻相結(jié)合，然后微藻處理污水的方式便和活性污泥處理污水的方式相同，結(jié)果表明，這種方式可以去除污水中92%的氮和94%的磷［5］。受第一次石油危機(jī)的影響，美國(guó)能源部可再生能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室于1978年啟動(dòng)了水生物種項(xiàng)目研究，該項(xiàng)目歷時(shí)19年、耗資2505萬(wàn)美元，且項(xiàng)目篩選出300余種產(chǎn)油藻種，重點(diǎn)開發(fā)適于微藻生物柴油生產(chǎn)的培養(yǎng)系統(tǒng)和制備工藝。直至20世紀(jì)90年代，日本國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部投資資金25億美元，用于支持 “地球研究更新技術(shù)計(jì)劃”，著力開發(fā)密閉光合生物反應(yīng)器技術(shù)，利用微藻吸收火力發(fā)電廠煙氣中的二氧化碳，將之轉(zhuǎn)化為有機(jī)能源生物能源；90年代后期油價(jià)大幅下降，微藻能源研究處于停滯狀態(tài)。21世紀(jì)以來(lái)微藻以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，重新成為研究的熱點(diǎn)，并作為污水處理及能源行業(yè)研究的重點(diǎn)。

2）微藻利用研究。20世紀(jì)50年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者證明了微藻是海洋中的主要初級(jí)生產(chǎn)者，是海洋生態(tài)系統(tǒng)和食物鏈的基礎(chǔ)，且驅(qū)動(dòng)著整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中起著不可替代的作用。如Tam等利用小球藻對(duì)模擬生活污水進(jìn)行脫氮除磷處理，結(jié)果表明，懸浮態(tài)小球藻對(duì)氮磷的去除率分別為40%和59%，而固定態(tài)小球藻對(duì)這兩種物質(zhì)的去除率達(dá)到了78%和94%［6］。此外，有研究表明固定化藻類可以回收污水中的重金屬，如Cu2+、Zn2+、Hg2+、Au3+等離子［7］。

微藻凈化污水具有較好的效果，目前對(duì)微藻凈化污水的機(jī)理的研究也較多，主要從脫氮除磷和吸附重金屬兩方面進(jìn)行研究。污水中的各種含氮化合物是微藻自身生長(zhǎng)繁殖所需的氮源，CO2和碳酸鹽等無(wú)機(jī)物作為碳源，在光照作用下進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，微藻吸收轉(zhuǎn)化后的化學(xué)物質(zhì)用于合成微藻自身的氨基酸、蛋白質(zhì)、其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)等［8-9］。

2005年，隨著生物能源發(fā)展，國(guó)外第一輛采用海藻燃料和大豆油（調(diào)合體積比為1∶9）為能源的示范轎車在印度完成實(shí)驗(yàn)，并實(shí)現(xiàn)了1500km的里程，打開微藻生物能源在交通運(yùn)輸中的開端。緊跟腳步，2007年美國(guó)國(guó)際能源公司啟動(dòng)了“海藻變油”的研發(fā)計(jì)劃，通過(guò)海藻的光合作用來(lái)生產(chǎn)可再生柴油和噴氣燃料。而應(yīng)用于航天的生物柴油，也隨著Solazyme等人利用異養(yǎng)法養(yǎng)殖高含油微藻研究變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

3）微藻利用機(jī)理研究。污水中的磷酸鹽可以通過(guò)直接吸收或通過(guò)磷酸化途徑轉(zhuǎn)化成ATP，或者以磷酸鹽的形式沉淀［10］。微藻的培養(yǎng)不僅僅是培養(yǎng)出生長(zhǎng)速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的微藻，更重要的是對(duì)微藻工程利用的機(jī)理加以探索，實(shí)現(xiàn)微藻的污水生物處理，體現(xiàn)理想的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)效益。目前對(duì)于微藻的誘變、選育以及產(chǎn)脂性能研究方面關(guān)注度較高，并且成果顯著［11］。

4）我國(guó)微藻固碳研究與生物能源技術(shù)研究較之國(guó)外起步較晚，但后期厚積爆發(fā)，取得不菲的成績(jī)。目前，在高產(chǎn)油藻種的選育與改造、高效微藻光反應(yīng)器、高密度培養(yǎng)、高效加工等技術(shù)研究［12］方面有了顯著進(jìn)步。

目前，微藻在分子生物學(xué)研究、污水處理工藝研究、脂肪積累機(jī)理等研究方面關(guān)注度較高，研究成果豐富。但是隨著環(huán)境問題的突出，是否導(dǎo)致微藻資源的變化，如種類和數(shù)量方面的變化，該方向值得深入研究。另一方面微藻資源的調(diào)查分析與種質(zhì)資源保存方面研究具有重大意義，種質(zhì)資源的保存有助于我們了解環(huán)境變化對(duì)生物的影響，為未來(lái)微藻研究積累資源。

2 微藻分離技術(shù)及流程

微藻分離指的是通過(guò)環(huán)境取樣，采集含有微藻的樣品（如水樣、土壤樣品等），通過(guò)適宜的培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)前期微藻富集增加微藻數(shù)量，再進(jìn)行微藻的分離工作，最終獲得純種微藻的過(guò)程。

2.1 微藻樣品采集

微藻種類繁多，適用能力極強(qiáng)，水環(huán)境中的淡水和咸水，以及土壤環(huán)境（一般土壤和沙漠土壤）均有微藻的分布，不同環(huán)境內(nèi)微藻樣品采集方式有所差異。

1）水環(huán)境微藻樣品的采集。淡水環(huán)境微藻水樣采集常用分層取樣的形式，采用水質(zhì)取樣器采集不同深度水樣，水樣采集后存放于無(wú)菌采樣瓶中［13］，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溫度等部分水樣常規(guī)指標(biāo)，其他指標(biāo)帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定。海水樣品的采集主要指海洋水樣的采集，采集后置于采樣瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)［14］。水環(huán)境樣品采集時(shí)除了采集水樣外，水體沉積物也需進(jìn)行采樣，如湖泊沉積物、海洋底泥等，用采樣鏟子將樣品標(biāo)本收集于取樣袋內(nèi)，帶回進(jìn)行微藻的分離培養(yǎng)。

2）土壤環(huán)境微藻樣品的采集。選取環(huán)境中含微藻的取樣點(diǎn)，用鏟子小心采集土壤表面層及其至10cm深處土壤，沙漠土壤樣品采集帶回實(shí)驗(yàn)室后直接用于后續(xù)分離培養(yǎng)試驗(yàn)［15］，收集于密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室的樣品，可在黑暗、室溫條件下保存［16］。

2.2 微藻培養(yǎng)基選擇

由于采集帶回實(shí)驗(yàn)室的樣品內(nèi)含有多種微生物，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等，快速、定向富集微藻需要優(yōu)選適宜的培養(yǎng)基，常見的培養(yǎng)基有SE培養(yǎng)基、BG11培養(yǎng)基、f／2培養(yǎng)基、D1培養(yǎng)基、BBM培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基和MA培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基用途及適宜微藻類型如表1。

表1 微藻分離常用培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為微藻的生長(zhǎng)提供碳源、氮源、水和各類無(wú)機(jī)生長(zhǎng)因子，因此在對(duì)未知微藻進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)，可對(duì)培養(yǎng)基的成分進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以適應(yīng)微藻研究需求。

這種突破性貢獻(xiàn)，也讓她個(gè)人取得無(wú)上殊榮——成為人類歷史上第一個(gè)兩度獲得諾貝爾獎(jiǎng)的人，各種獎(jiǎng)金與頭銜更是不勝枚舉。

2.3 微藻富集過(guò)程

微藻富集指的是利用適宜培養(yǎng)基，將采集微藻樣品接種于培養(yǎng)基內(nèi)，一方面快速增加微藻數(shù)量，另一方面抑制其他生物的生長(zhǎng)。常見加速富集速率的方法有樣品預(yù)處理、培養(yǎng)基的優(yōu)化［21］、抑菌方案的篩選［22］和培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)。

采集回實(shí)驗(yàn)室的樣品首先進(jìn)行微藻的顯微鏡檢測(cè)，若微藻數(shù)量較高，則直接進(jìn)行微藻分離，否則將采取富集培養(yǎng)的方式。在富集培養(yǎng)之前，需對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)處理，如去除大的砂石和土壤顆粒、水樣進(jìn)行初步過(guò)濾，去除非目標(biāo)生物等。

培養(yǎng)基優(yōu)化，淡水培養(yǎng)基常用BG11和SE，但是培養(yǎng)基的pH值和培養(yǎng)條件可進(jìn)行優(yōu)化，甚至可在培養(yǎng)基內(nèi)加入土壤浸提液或者原位滅菌的水樣。如響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的BG11培養(yǎng)基適宜于養(yǎng)豬廢水內(nèi)刺鏈帶藻的生長(zhǎng)［23］，研究學(xué)者優(yōu)化后的培養(yǎng)基可作為微藻富集分離培養(yǎng)基。

抑菌方案的設(shè)計(jì)，抑菌方案主要通過(guò)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)，如培養(yǎng)基內(nèi)缺少C源且光照培養(yǎng)可定向培養(yǎng)光能自養(yǎng)微藻，進(jìn)行黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)能夠篩選異養(yǎng)生長(zhǎng)的微藻，寡異養(yǎng)培養(yǎng)基可抑制大部分微生物的生長(zhǎng)，加入抗生素可抑制微生物的同時(shí)定向篩選微藻［22］。

微藻培養(yǎng)條件的不同，將微藻培養(yǎng)方式分為光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)，不同微藻的生長(zhǎng)類型不同，需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。常見微藻培養(yǎng)條件為21～25℃、光暗周期為 12h，如月牙藻［24］、小球藻［25］和柵藻［26］等的培養(yǎng)。除此以外，光暗比 14∶10 h、16∶8 h、全光照和無(wú)光照［22］等條件也在微藻篩選中被應(yīng)用。培養(yǎng)至富集微藻液體顏色發(fā)生顯著變化時(shí)，取部分樣品進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，目標(biāo)微藻成為優(yōu)勢(shì)藻并且達(dá)到分離濃度即可進(jìn)入下一步微藻分離的過(guò)程。

2.4 微藻分離技術(shù)

2.4.1 平板分離技術(shù)

微藻培養(yǎng)過(guò)程中若改變pH條件，以及減小凝固劑對(duì)微藻的影響，可將瓊脂換為結(jié)冷膠，以提高純化效果。另外，在純化過(guò)程中，為了適用不同微藻類群，也可采取半固體培養(yǎng)基進(jìn)行微藻的分離試驗(yàn)。

2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)板分離技術(shù)

該方法原理為稀釋分離法，將微藻富集液稀釋至適宜濃度，直至每一份樣品內(nèi)僅含有單個(gè)微藻細(xì)胞時(shí)，對(duì)單個(gè)微藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如微藻細(xì)胞培養(yǎng)板分離技術(shù)，該方法將富集藻液進(jìn)行稀釋，稀釋至1～10滴稀釋液內(nèi)僅含有一個(gè)微藻細(xì)胞為止，然后在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入1滴稀釋液，并再加入無(wú)菌培養(yǎng)液，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后用倒置顯微鏡觀察微藻生長(zhǎng)情況，用無(wú)菌滴管吸出藻液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即可獲得純種微藻藻株。

2.4.3 單細(xì)胞吸取技術(shù)

該方法通過(guò)一定的儀器和設(shè)備直接取出富集液內(nèi)的特定微藻細(xì)胞，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)，常見的有顯微操作技術(shù)，流式細(xì)胞儀技術(shù)。顯微操作技術(shù)指的是在顯微鏡下找到單個(gè)的微藻細(xì)胞，用毛細(xì)管玻璃針吸取單個(gè)細(xì)胞，放于培養(yǎng)液內(nèi)單獨(dú)培養(yǎng)，該方法可快速獲取純種微藻細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀輔助技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞快速檢測(cè)、識(shí)別與分選，通過(guò)前期對(duì)微藻的富集培養(yǎng)，提高微藻數(shù)量，然后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微藻種類的檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)定向高效分選微藻，獲得純種微藻藻株。

3 微藻鑒定技術(shù)

3.1 形態(tài)鑒定

前期分離的純種微藻，用接種針挑取少量于載玻片上，加蓋玻片后顯微鏡觀察，在高倍鏡下記錄其顯微形態(tài)與顏色。微藻顯微鏡觀察前可采用魯格氏液固定［27］、結(jié)晶紫染色［28］等方式讓微藻形態(tài)更為明顯。根據(jù)觀察到的形態(tài)，參考《中國(guó)淡水藻類-系統(tǒng)、分類及生態(tài)》對(duì)微藻進(jìn)行初步分類鑒定。此外可配合掃描電鏡對(duì)微藻細(xì)胞表面形態(tài)進(jìn)行觀察，加強(qiáng)顯微鑒定的準(zhǔn)確性。

3.2 分子鑒定

分子鑒定技術(shù)通過(guò)對(duì)微藻的18 SrDNA測(cè)序和比對(duì)，實(shí)現(xiàn)種群的鑒定。具體操作方法為：首先將純種高濃度藻液離心收集微藻細(xì)胞，采用CTAB、試劑盒等法提取微藻DNA，獲得高純度DNA；其次對(duì)微藻18sr DNA設(shè)計(jì)引物［28］，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)程序，對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增片段的測(cè)序，由序列測(cè)序公司完成（如上海生工、華大基因等）；測(cè)序完成片段去除兩段無(wú)效片段，將中間片段輸入NCBI內(nèi)進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的數(shù)據(jù)庫(kù)已知微藻DNA序列，與目標(biāo)序列采用MEGA等軟件進(jìn)行聚類分析，分析目標(biāo)微藻的種群聚類，最終實(shí)現(xiàn)微藻的鑒定，若相似性低于97%，則可判斷為新種微藻［28］。

4 富油微藻篩選技術(shù)

分離鑒定的微藻需快速檢測(cè)其油脂含量，或者從大批量微藻中篩選出富油微藻，采用尼羅紅染色是較為迅速的檢測(cè)手段，使用尼羅紅對(duì)微藻進(jìn)行染色，以三油精為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，480nm為激發(fā)波長(zhǎng)，580nm為吸收波長(zhǎng)測(cè)定熒光值，根據(jù)熒光值測(cè)定油脂含量［28］，快速篩選富油微藻的尼羅紅染色法、是一種很好的初級(jí)篩選方法。此外，總脂含量的索氏提取測(cè)定方法［29］、乙酸乙酯／正己烷混合溶劑萃取法［30］，脂肪酸的 GCMs測(cè)定方法［31］均能夠?qū)ξ⒃逵椭瑱z測(cè)，實(shí)現(xiàn)富油微藻的篩選。通過(guò)藻種比生長(zhǎng)速率、生物量以及油脂含量的測(cè)定，建立了優(yōu)良藻種的綜合評(píng)價(jià)方法［32］。

5 微藻發(fā)展趨勢(shì)

隨著國(guó)內(nèi)化石燃料的大量消耗，生物柴油，尤其是微藻生物能源的開發(fā)異常迅速。目前對(duì)微藻的開發(fā)主要集中在富油微藻的篩選與育種、微藻生物柴油的工業(yè)生產(chǎn)與開發(fā)。在前期微藻篩選階段，由于自然環(huán)境微藻資源的豐富性，每年都有新種微藻被發(fā)現(xiàn)，甚至部分微藻在人工培養(yǎng)條件下難以獲得純種的藻株。因此，開發(fā)新的微藻篩選工藝、新的微藻培養(yǎng)方法、新的微藻保存措施等可有效加速微藻資源的探索與開發(fā)。甚至通過(guò)微藻資源的調(diào)查，將微藻在生物能源、食品、醫(yī)療、化妝品、化工等等諸多領(lǐng)域開拓。