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    高中生物“探究酵母菌種群數(shù)量的變化”實(shí)驗(yàn)方案改進(jìn)

    2020-08-12 01:02:18
    科教導(dǎo)刊 2020年21期
    關(guān)鍵詞:去離子水菌液酵母菌

    杜 靜 呂 樂

    ([1]首都師范大學(xué)附屬育新學(xué)校 北京 100096;[2]北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 北京 100083)

    釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為一種微小的單細(xì)胞真菌,在食品發(fā)酵方面已有十分悠久的使用歷史,其兼性厭氧特性和產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力被利用作為食品發(fā)酵劑。釀酒酵母作為酵母屬中的重要組成部分,被廣泛使用于果酒的發(fā)酵中。[1]釀酒酵母的生長(zhǎng)能力強(qiáng)且具有益生作用,對(duì)人體無毒害,適合作為高中生物課程的實(shí)驗(yàn)材料。

    1 酵母種群數(shù)量變化實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)措施

    普通高中《生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)》選擇性必修課程模塊2《生物與環(huán)境》“探究培養(yǎng)液中某種酵母種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化”實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生達(dá)成概念2的理解,促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)的提升,并能夠運(yùn)用數(shù)學(xué)模型表征種群數(shù)量變量的規(guī)律。[2]但課本中該實(shí)驗(yàn)采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),血球計(jì)數(shù)板需要使用上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室,計(jì)數(shù)時(shí)間比較長(zhǎng)且精確度較低,學(xué)生操作難度及誤差較大。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)為使用分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度,每次取樣后均置于4℃冰箱,待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)一測(cè)定,每個(gè)樣品測(cè)定3次取均值,便于學(xué)生操作且減小實(shí)驗(yàn)誤差。為縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間采用豆芽汁低葡萄糖培養(yǎng)基,低葡萄糖濃度能夠加快酵母生長(zhǎng)曲線不同時(shí)期的轉(zhuǎn)變,并且采用200rpm,30℃恒溫培養(yǎng)條件,加快菌體生長(zhǎng)速度,使實(shí)驗(yàn)在2天內(nèi)基本完成以適應(yīng)高中實(shí)驗(yàn)課進(jìn)度。為使菌株的生長(zhǎng)延遲期易于觀察,采用萬分之一的接種量以避免迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期。通過設(shè)計(jì)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的菌液接種時(shí)間,取樣時(shí)間及間隔,鍛煉學(xué)生的思考探究能力,通過觀察預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷生長(zhǎng)速度及取樣方式,以減少實(shí)驗(yàn)失敗幾率。

    本實(shí)驗(yàn)利用學(xué)生自制的傳統(tǒng)發(fā)酵食品果酒中篩選得到的酵母菌菌株,并進(jìn)行18S rDNA測(cè)序分析,豐富了實(shí)驗(yàn)過程與內(nèi)容,鍛煉了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作能力及解決困難的能力,并使其對(duì)酵母的來源及生理特性有了較全面的認(rèn)識(shí)與了解。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行液體培養(yǎng)并測(cè)定菌體濃度的變化,繪制酵母菌的生長(zhǎng)曲線。在學(xué)生理解理想條件下種群的“J型”生長(zhǎng)模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步討論在有限制的現(xiàn)實(shí)條件下種群的生長(zhǎng)情況,并對(duì)得到的生長(zhǎng)曲線劃分生長(zhǎng)階段,從而更好地理解“S型”生長(zhǎng)曲線各階段的特征及產(chǎn)生原因。[3]實(shí)驗(yàn)過程中涉及微生物的液體培養(yǎng)、基因組提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、菌液的稀釋及濃度測(cè)定、生長(zhǎng)曲線的繪制及分析等內(nèi)容,是涵蓋多方面課程知識(shí)的綜合實(shí)驗(yàn),能夠提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰胺治鎏骄磕芰Γ哂休^高的可操作性和實(shí)踐性。

    2 實(shí)驗(yàn)的開展方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

    2.1.1 菌種

    2.1.2 試劑與材料

    自制果酒,黃豆芽,葡萄糖,去離子水,無水乙醇,瓊脂粉等。

    2.1.3 儀器設(shè)備

    儀器:錐形瓶,比色皿,移液器,試管等;

    設(shè)備:722型分光光度計(jì),4℃冰箱,恒溫培養(yǎng)搖床,電泳儀,基因擴(kuò)增儀、高壓滅菌鍋,電子天平等。

    2.2 研究方法

    2.2.1 培養(yǎng)基的配制

    配制豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基:在100mL去離子水加入10g黃豆芽煮沸30min,用紗布過濾,補(bǔ)足損失水量后制得10%豆芽汁。取10%豆芽汁100mL,加入3g葡萄糖,搖勻,分裝到500mL錐形瓶中制得液體培養(yǎng)基,每組配制16瓶;另取液體培養(yǎng)基,再加入2g瓊脂混勻制得固體培養(yǎng)基,每組配制4瓶。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行。將培養(yǎng)基,去離子水等實(shí)驗(yàn)物品在121℃下高壓滅菌20min,冷卻至室溫。

    作為中國(guó)農(nóng)資流通第一股,安徽輝隆集團(tuán)的展位上,重點(diǎn)展示了以高效功能化的水溶肥系列、中微量元素復(fù)合肥系列、作物專用復(fù)合肥系列為代表的綠色生態(tài)肥,產(chǎn)品的科技含量和肥料利用率均創(chuàng)新高。無獨(dú)有偶,在參展產(chǎn)品中,“六國(guó)網(wǎng)”控失肥是六國(guó)化工與中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院合力打造的環(huán)保高效新型肥料,在提高肥料利用率、降低農(nóng)業(yè)污染方面取得了突破性成果,并延伸出多種作物專用肥及“六國(guó)網(wǎng)+全程營(yíng)養(yǎng)解決方案”,同樣以科技含量高而吸引了眾多參觀者圍觀咨詢。

    2.2.2 菌株的分離與純化

    在超凈工作臺(tái)中取1mL果酒樣品加入到9mL的無菌去離子水中,混合均勻,取1mL稀釋液到9mL無菌去離子水中混合,重復(fù)此步驟,得到10-1到10-6的稀釋液。選擇10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋梯度,分別吸取100uL稀釋液加入無菌固體培養(yǎng)基表面,用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面涂布使菌液均勻鋪開。在30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至有明顯菌落長(zhǎng)出,依據(jù)酵母菌菌落形態(tài)特征初篩,挑取優(yōu)勢(shì)菌的單菌落至液體培養(yǎng)基中,在30℃,200rpm條件下振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁,再次在固體培養(yǎng)基平板上涂板,重復(fù)步驟直至平板上為單一菌落。

    2.2.3 酵母菌基因組DNA的提取與鑒定

    將純化單菌挑至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),獲得菌液,按照酵母菌基因組提取試劑盒(上海生工B518257)說明進(jìn)行基因組DNA提取,以提取物作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poLymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,引物為ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’),循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性反應(yīng)4min;94℃變性反應(yīng)30s,54℃退火反應(yīng)30s,72℃延伸反應(yīng)45s,循環(huán)30次;最后在72℃下延伸反應(yīng)10min得到擴(kuò)增后DNA樣本,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并送到上海生工測(cè)序。在NCBI網(wǎng)站中將所測(cè)序列進(jìn)行BLAST分析,獲得菌株信息。

    2.2.4 接種

    在超凈工作臺(tái)中,向3組13個(gè)裝有100mL的滅菌培養(yǎng)基中分別加入1mL酵母菌菌懸液,輕輕振蕩混勻,并每組設(shè)置1個(gè)不加菌液的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。將錐形瓶編號(hào)并置于恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為30℃,200rpm振蕩培養(yǎng)。

    2.2.5 取樣

    在培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、24、27、30、33、36、39、42、48h后分別取樣,即每隔3小時(shí)各組均取出一瓶樣品置于4℃冰箱中,做好標(biāo)記。

    2.2.6 OD值的測(cè)定

    在取樣結(jié)束后,取3組16支干凈試管,將不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的菌液及空白對(duì)照組培養(yǎng)基搖勻并各取5mL到試管中,編寫序號(hào),將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使光密度處于0.1~0.65之間,以未接種的空白對(duì)照組液體培養(yǎng)基調(diào)零點(diǎn),在680nm波長(zhǎng)處,1cm比色皿中依次測(cè)定OD值。測(cè)定從濃度最低的菌懸液開始依次測(cè)定,測(cè)定兩個(gè)樣品間需要用去離子水多次沖洗比色皿。經(jīng)稀釋后的菌液OD值需要乘以稀釋倍數(shù)以得到實(shí)際OD值。

    2.2.7 生長(zhǎng)曲線的繪制

    記錄測(cè)量得到的實(shí)際OD值數(shù)據(jù),計(jì)算3組平行實(shí)驗(yàn)的平均值,制成曲線圖并進(jìn)行分析。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    菌株18S rDNA的測(cè)序結(jié)果為:AAACTCGGAAGGATCATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGAAAAA…經(jīng)過序列比對(duì)得到所篩菌株為釀酒酵母。

    對(duì)3組平行實(shí)驗(yàn)菌液的OD值取平均值,繪制得到如圖1所示的生長(zhǎng)曲線圖??梢钥闯鼋湍妇w濃度呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢(shì),基本符合經(jīng)典“S型”生長(zhǎng)曲線中各階段的特征。[4]0-6h左右菌體生長(zhǎng)緩慢,濃度幾乎沒有增加,為生長(zhǎng)延遲期,即酵母菌接種到新的培養(yǎng)基后,其代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境,同時(shí)需要合成酶、輔酶、其他代謝中間代謝產(chǎn)物等,所以此時(shí)期的細(xì)胞數(shù)目基本沒有增加;6-30h左右為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此階段適應(yīng)了新環(huán)境的酵母菌生長(zhǎng)速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、菌液濃度快速增加,同時(shí)外界環(huán)境也是最佳狀態(tài);30-33h為穩(wěn)定期,酵母菌經(jīng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的大量繁殖,消耗了培養(yǎng)基的大量營(yíng)養(yǎng)及氧氣,所產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物使得酵母的繁殖受到抑制,并開始出現(xiàn)衰老死亡,死亡數(shù)量與增殖的酵母數(shù)基本持平,此時(shí)達(dá)到酵母菌生物量的峰值。33h以后菌液濃度開始下降,此階段為衰亡期,經(jīng)過前面的不斷消耗,使得培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越來越少,酵母菌的繁殖得不到充分的營(yíng)養(yǎng),同時(shí)外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來越不利,大量代謝產(chǎn)物的抑制,細(xì)胞的分解代謝大于合成代謝,導(dǎo)致此階段酵母死亡數(shù)量高于增殖數(shù)量,酵母總數(shù)不斷減少,整個(gè)群體出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。

    圖1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

    在一定體積的液體培養(yǎng)基中,接種后的少量酵母迅速形成一個(gè)酵母種群,由于養(yǎng)分、空間、溫度和有毒排泄物等的影響,使酵母種群的數(shù)量有著類似于自然界中資源和空間有限的其他生物種群的增長(zhǎng)規(guī)律,能夠一定程度上模擬自然條件下微生物的生產(chǎn)規(guī)律。[5]由于微生物的生長(zhǎng)受到多方面因素的影響,培養(yǎng)基中糖的種類和濃度均對(duì)酵母的生長(zhǎng)有影響,因此在指定培養(yǎng)基中酵母的生長(zhǎng)曲線具有一定的特殊性,僅能代表一定培養(yǎng)條件下酵母的生長(zhǎng)特性。[6]實(shí)驗(yàn)中3個(gè)平行組的平均值得到的生長(zhǎng)曲線基本符合“S型”曲線特征,能夠清晰地看出各時(shí)間段釀酒酵母在液體培養(yǎng)基中的群落動(dòng)態(tài)變化,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目標(biāo)。

    4 總結(jié)

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)高中課程要求試驗(yàn)進(jìn)行了豐富和改進(jìn),更加符合目前高中生的能力水平與教學(xué)要求,并且提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可操作性,符合高中課程的時(shí)間安排與實(shí)際需求。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)作為果酒制作以及酵母篩選培養(yǎng)的后續(xù)實(shí)驗(yàn),能夠從多方面鍛煉學(xué)生的時(shí)間安排能力與問題解決能力,使其認(rèn)識(shí)到科學(xué)研究不僅需要嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的腦力勞動(dòng),而且需要艱辛刻苦的體力付出,并利于學(xué)生理解微生物的生長(zhǎng)特性同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生探究分析能力和實(shí)驗(yàn)操作技能。

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