生物肥料對當(dāng)歸生長及土壤酶活性、微生物多樣性的影響

李 娟，王文麗，趙 旭

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070）

【研究意義】當(dāng)歸（Angelica sinensis）為常用中藥材，屬中醫(yī)婦科用藥，是補(bǔ)血活血、去瘀生新、潤腸通便、調(diào)經(jīng)止痛的良好藥物［1-2］。當(dāng)歸主產(chǎn)甘肅、陜西、云南和四川，有效成分為阿魏酸［3］、多糖、揮發(fā)油等，阿魏酸具有清除自由基的作用，能抑制血小板聚集和血栓形成［4］。甘肅當(dāng)歸產(chǎn)量最大、質(zhì)量最好，栽培歷史最為悠久［5］。甘肅當(dāng)歸正常年產(chǎn)量約1萬t左右，占全國年產(chǎn)量95%以上，是當(dāng)?shù)刈罹邇?yōu)勢的特色藥材之一［6］。甘肅當(dāng)歸的主產(chǎn)區(qū)在岷縣，還有周邊的渭源縣、康樂縣、卓尼縣、宕昌縣。隨著當(dāng)歸需求量日益增加，大量種植造成連作面積不斷提高，多年連作導(dǎo)致當(dāng)歸生長發(fā)育不良，產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)量下降，抗病能力降低，土壤環(huán)境逐年惡化，根病加重［7］。而導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化的原因是連作使部分土壤養(yǎng)分異常積累，另一部分養(yǎng)分過度消耗，病原微生物迅速繁衍，土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失調(diào)，引發(fā)作物品質(zhì)及產(chǎn)量下降［8-10］。有些生物有機(jī)肥所含的微生物對病菌有抑制作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物菌劑和生物有機(jī)肥已應(yīng)用在多種作物上，施用生物有機(jī)肥（菌肥）可有效改善土壤性質(zhì)、提高土壤養(yǎng)分，通過增加根系活力、提高作物對營養(yǎng)元素的吸收利用使作物增產(chǎn)或提高抗病性［11］。微生物菌劑和有機(jī)肥在當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來越受重視，生物肥料在設(shè)施蔬菜［13］、馬鈴薯［14］、玉米［15］、水稻［16］、果樹［17］等多種作物上都有顯著增產(chǎn)效果，促進(jìn)作物對養(yǎng)分的吸收，增強(qiáng)作物的抗病性。用于生產(chǎn)生物肥料的菌種種類很多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)包括假單胞菌和芽胞桿菌等20多個屬的根圍細(xì)菌具有防病促生潛能［12］。但針對當(dāng)歸的專用抗病促生生物肥料較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】抗病型生物肥料DZF-363是由抗病菌株DG-16-2、DG-23復(fù)合而成。DG-16-2、DG-23是從當(dāng)歸根際分離的具有抑制鐮刀菌等病原微生物生長的拮抗菌株，對當(dāng)歸有顯著促生效果。【擬解決的關(guān)鍵問題】為探明生物肥料DZF-363的作用機(jī)理，進(jìn)行了生物肥料在當(dāng)歸上的盆栽試驗(yàn)，以期為肥料的推廣和當(dāng)歸安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生物肥料DZF-363由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所微生物研究室提供，含有機(jī)質(zhì)442 g/kg、全氮10.82 g/kg、全磷5.1 g/kg、全鉀12.3 g/kg、全鹽17.22 g/kg、pH7.5、兩種菌（壁芽孢桿菌Bacillus muralisDG-23和油菜假單胞菌PseudomonasbrassicacearumDG-16-2）的活菌數(shù)均≥2.5×108cfu/g。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)施用載體10 g/盆、生物肥料DZF-363 10 g/盆和空白對照3個處理，每個處理8次重復(fù)。

試驗(yàn)在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚進(jìn)行，采用塑料花盆，每盆裝土750 g、蛭石粉150 g。移栽前將土樣750 g與150 g蛭石粉、10 g生物肥料（或載體）充分混勻后裝盆。移栽前灌水按基質(zhì)重的35%計(jì)，即每盆灌水375 mL。每個處理裝盆10盆，當(dāng)歸每盆移栽2株，生長30 d后每處理選擇長勢良好的8盆作為重復(fù)，定植1株，生長90 d后收獲，測定當(dāng)歸地上部、地下部鮮重和干重；取新鮮土壤過1 mm篩進(jìn)行土壤脲酶、磷酸酶活性及微生物群落多樣性測定。試驗(yàn)于2019年3月23日移栽，4月25日定苗，7月29日收獲。

當(dāng)歸植株的收獲及土樣取樣：將當(dāng)歸與土全部從花盆倒出，把周圍土抖落，將根上的土抖到牛皮紙上，植株裝入塑料袋中，土樣每兩盆混合均勻裝入1個自封袋中。將根沖洗干凈后用紙吸干水，進(jìn)行稱重；植株進(jìn)行株高、根長、根粗測量，風(fēng)干后分別稱地上部和根干重。

土壤中可培養(yǎng)的微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）采用稀釋平板法測定；土壤脲酶活性測定采用靛酚比色法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法［18］。

土壤微生物群落碳代謝多樣性采用Biolog-MicroPlate方法進(jìn)行［19-20］：稱取10 g新鮮土壤加入裝有90 mL無菌生理鹽水錐形瓶中（0.85%NaCl溶液）。搖床振蕩30 min，靜置30 min，取上清液5 mL加入到45 mL無菌生理鹽水中，稍加振蕩后倒入V型接種槽，用八道移液器接種到Biolog Eco微平板，每個孔接種150 μL，25℃培養(yǎng)192 h，每24 h讀數(shù)1次，將OD值導(dǎo)出，用590 nm的OD值減去750 nmOD值的差值計(jì)算平均顏色變化率、豐富度等。

（1）平均顏色變化率（average well color development，AWCD），表示微生物群落的碳源代謝強(qiáng)度，是土壤微生物活性及功能多樣性的一個重要指標(biāo)［21-22］。采用各Eco-MicroPlate吸光值數(shù)據(jù)計(jì)算：

式中，Ci為除對照孔外各孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值差，R為對照孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值的差，n為31種碳源。

（2）Shannon-Wiener物種豐富度指數(shù)（H’），用于評估群落的物種豐富度：

式中，Pi為不同碳源的微孔和對照孔吸光值的差值與整個微板總體差值之和的比值：

式中，Ci為每個微板孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值差，R為對照孔590 nm的OD值減去750 nm的OD值的差，n為31種碳源。

（3）McIntosh物種均一度指數(shù)（U）。

式中，ni為第i反應(yīng)孔與對照孔的差值（ni=Ci-R）。

（4）辛普森指數(shù)又稱優(yōu)勢度指數(shù)（D），是對多樣性方面的集中性度量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行處理，采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物肥料對當(dāng)歸生長的影響

表1結(jié)果顯示，施用生物肥料和載體處理對當(dāng)歸根生長都有顯著促進(jìn)作用，尤其是對當(dāng)歸根干重、蘆頭直徑有顯著促進(jìn)作用。與對照相比，施用生物肥料后當(dāng)歸的根干重、蘆頭直徑分別增加100.5%、31.39%，施用載體處理當(dāng)歸的根干重、蘆頭直徑分別增加28.1%、10.31%，差異顯著。

表1 不同處理對當(dāng)歸生長的影響Table 1 Effects of different treatments on the growth of A. sinensis

2.2 生物肥料對當(dāng)歸根際土壤微生物數(shù)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，在當(dāng)歸根際施用生物肥料可以顯著增加根際土壤細(xì)菌、真菌、防線菌數(shù)量。與對照相比，生物肥料處理細(xì)菌、真菌、放線菌分別增加154%、21.6%、34.7%，差異顯著，載體處理分別增加78%、20.1%、6.5%；生物肥料處理與載體處理相比，細(xì)菌、真菌、放線菌分別增加42.6%、1.27%、26.5%。說明生物肥料中的有機(jī)物料能顯著增加土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量，而菌劑的加入使土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量大幅度提高。

細(xì)菌與放線菌之和與真菌數(shù)量的比值是土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的重要特征指標(biāo)［23］。通過細(xì)菌和放線菌數(shù)量之和與真菌數(shù)量的比值分析土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，從表2可以看出，使用生物肥料可以顯著改變當(dāng)歸根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。與對照和載體處理相比，生物肥料處理的比值分別增加92.6%、39.2%，說明施用生物肥料可以顯著改變當(dāng)歸根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。

2.3 生物肥料對當(dāng)歸根際土壤脲酶和磷酸酶活性的影響

2.3.1 對土壤脲酶活性的影響 土壤酶是表征土壤中物質(zhì)、能量代謝旺盛程度和土壤質(zhì)量水平的一個重要生物指標(biāo)［24］。表3顯示，在當(dāng)歸根際施用生物肥料能夠顯著增加土壤脲酶活性。與對照相比，生物肥料處理的脲酶活性增加46.9%，與載體處理相比增加9.09%，差異顯著。

2.3.2 對土壤磷酸酶活性的影響 磷酸酶可以加速有機(jī)磷的脫磷速度，積累的磷酸酶對土壤磷素的有效性具有重要作用［25］。表3結(jié)果表明，與對照相比，生物肥料處理土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性分別增加19.9%、43%，差異顯著；與載體處理相比，分別增加9.66%、8.51%。

2.4 生物肥料對土壤微生物功能多樣性影響

2.4.1 對土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）的影響 AWCD反映土壤微生物的整體活性［26］，可作為土壤微生物活性的有效指標(biāo)［19,27］，不同施肥處理土壤的AWCD分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，不同施肥處理土壤微生物AWCD的總體變化趨勢隨著時(shí)間延長而逐漸提高，在培養(yǎng)24～120 h期間，曲線斜率最大，AWCD增長率最高，表明此階段土壤微生物碳源代謝活性最高。不同處理間相比，施生物肥料處理AWCD值高于載體處理和對照，可見，施用生物肥料能提高土壤微生物代謝活性。

圖1 不同處理對土壤微生物AWCD的影響Fig. 1 Effects of different treatments on soil microganism AWCD

2.4.2 對土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響 通過計(jì)算培養(yǎng)120 h時(shí)的Shannon-Wiener物種豐富度指數(shù)（H'）、McIntosh物種均一度指數(shù)（U）、物種優(yōu)勢度指數(shù)（D）來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性［28-29］。表4結(jié)果表明，在當(dāng)歸根際施用生物肥料后，土壤中微生物群落功能多樣性指數(shù)的變化趨勢與微生物利用單一碳源能力的趨勢基本一致，都是生物肥料處理最高，載體處理次之，對照最小。與對照相比，物種豐富度指數(shù)、均一度指數(shù)分別增加40.2%、6.6%；與載體處理相比，分別增加25.5%、1.6%；物種優(yōu)勢度指數(shù)（Sinpson）不同處理間基本無影響。說明施用生物肥料可以提高當(dāng)歸根際土壤微生物豐富度指數(shù)和物種均一度指數(shù)，對物種優(yōu)勢度指數(shù)基本無影響。

表2 不同處理對當(dāng)歸根際土壤微生物數(shù)量的影響Table 2 Effects of different treatments on number of microorganisms in rhizosphere soil of A. sinensis

表3 不同處理對當(dāng)歸根際土壤酶活性的影響Table 3 Effects of different treatments on enzyme activity in rhizosphere soil of A. sinensis

表4 不同處理對當(dāng)歸根際土壤生物功能多樣性指數(shù)的影響Table 4 Effects of different treatments on functional diversity indexes of rhizosphere soil of A. sinensis

2.4.3 生物肥料對單一碳源的影響 不同施肥措施對土壤微生物群落碳源利用能力產(chǎn)生不同影響。AWCD高低可用來表征微生物對碳源的利用率高低［26］。計(jì)算出Eco-microPlate上的31種碳源96 h的Ci-R 值平均值，對變化較大的14種碳源進(jìn)行分析，表5結(jié)果顯示，施用生物肥料后可顯著提高D-木糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D，L-α-甘油、I-赤藻糖醇、N-乙酰基-D-葡萄胺7種碳源的利用率，降低了L-絲氨酸、丙酮酸甲酯、腐胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、衣康酸、D-蘋果酸7種碳源的利用率，使單一碳源的代謝發(fā)生變化。與對照相比，生物肥料處理的D-木糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-苯基丙氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、D，L-α-甘油、I-赤藻糖醇、N-乙酰基-D-葡萄胺的利用率分別增加89.8%、86.8%、17.3%、14.0%、35.5%、21.7%、91.3%；碳源L-絲氨酸、丙酮酸甲酯、腐胺、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、衣康酸、D-蘋果酸分別降低了18.2%、10.2%、12.2%、16.0%、10.4%、5.9%、15.5%。碳源利用發(fā)生了變化，說明微生物種群發(fā)生變化，施用生物肥料改變了微生物群落結(jié)構(gòu)。

表5 不同處理對單一碳源的影響Table 5 Effects of different treatments on single carbon source

3 討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動力，其群落結(jié)構(gòu)組成及其變化在一定程度上反映土壤質(zhì)量，同時(shí)也是克服連作障礙及其他土壤障礙因子的關(guān)鍵。楊永等［30］研究表明，在哈密瓜上施用微生物肥料能改變土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，降低根際病原真菌數(shù)量，使大量有益真菌繁衍。唐艷領(lǐng)［31］研究表明，在嚴(yán)重連作土壤上對辣椒施用微生物肥料能夠提高土壤中微生物數(shù)量，提高土壤酶活性，降低辣椒疫病的發(fā)生。胡麗可［32］在連作大棚中施用5406菌肥，辣椒根際土壤中細(xì)菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量減少，土壤酶脲酶、蔗糖酶、過氧化物酶活性顯著提高，也可以提高辣椒的品質(zhì)?？梢娚锓柿峡梢杂行p輕土壤連作障礙的發(fā)生，增加土壤微生物數(shù)量和提高酶的活性，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究在當(dāng)歸上施用生物肥料后，當(dāng)歸根際土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌都顯著增加，土壤脲酶、磷酸酶活性顯著增加，與前人研究結(jié)果基本一致。通過Biolog-MicroPlate方法測定微生物對31種的利用情況，表明生物肥料改變了14種碳源的利用率，施用生物肥料可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的多樣性與均勻性不僅提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與和諧性，同時(shí)也提高對土壤微生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力［33］。土壤中微生物數(shù)量在一定程度上影響土壤酶的活性，土壤中酶活性是土壤肥力的一個重要指標(biāo)［34］。施用生物肥料可以顯著提高土壤脲酶、磷酸酶的活性。耿士均等［35］研究表明微生物菌劑和生物有機(jī)肥可顯著改善植物根周的微環(huán)境，調(diào)節(jié)菌群種類和數(shù)量，促進(jìn)有益菌群的生長，土壤中微生物含量增加，可以提高各種酶活性。酶活性與上壤中各營養(yǎng)元素的釋放與發(fā)育土壤中腐殖質(zhì)的形成以及土壤的結(jié)構(gòu)和物理狀況密切相關(guān)。張輝等［36］研究表明，生物有機(jī)無機(jī)復(fù)合肥可明顯提高土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化和速效養(yǎng)分釋放。本研究結(jié)果表明，施用生物肥料增加了土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，提高了微生物的活性和土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)多樣性［37］；土壤中微生物含量增加，從而提高了土壤的脲酶、磷酸酶等活性，由于酶促反應(yīng)增強(qiáng)，加速了土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦物質(zhì)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，有利于農(nóng)作物根系對養(yǎng)分的吸收，從而提高當(dāng)歸的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸專用生物肥料對當(dāng)歸根的生長有顯著促進(jìn)作用，施用生物肥料后當(dāng)歸的蘆頭直徑和根干重顯著增加，與對照相比，分別增加了31.39%、100.5%，提高了當(dāng)歸的商品性。施用生物肥料增加了土壤微生物的數(shù)量，與對照相比，細(xì)菌、真菌、放線菌分別增加154%、21.6%、34.7%，使土壤微生物功能多樣性發(fā)生變化；提高了土壤脲酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性，較對照分別增加46.9%、19.9%、43.0%。土壤中微生物數(shù)量增加，提高了土壤酶活性，加速了土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦物質(zhì)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，有利于農(nóng)作物根系對養(yǎng)分的吸收，從而提高當(dāng)歸產(chǎn)量。