EuCAD基因小片段RNAi對(duì)煙草木質(zhì)素合成的影響

陳博雯，肖玉菲，李軍集，張 燁，覃子海，張曉寧，劉海龍

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/國(guó)家林業(yè)和草原局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002）

【研究意義】桉樹(shù)（Eucalyptus）是原產(chǎn)澳大利亞的桃金娘科桉屬植物的總稱［1-2］，20世紀(jì)80年代引種至我國(guó)后，已選育出巨尾桉、鄧恩桉、大花序桉等速生、耐寒、大徑材優(yōu)良品種，是我國(guó)目前南方的主要速生用材林造林樹(shù)種［3-5］。廣西桉樹(shù)種植面積居全國(guó)首位，其木材被廣泛用于制漿造紙、人造板和纖維板等，特別是在造紙木漿生產(chǎn)中有著極重要地位［6-8］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在傳統(tǒng)選育優(yōu)良紙漿材品種的基礎(chǔ)上，針對(duì)木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵基因，利用基因工程手段調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而改良木材品質(zhì)是研究的熱點(diǎn)［9-10］。CAD是木質(zhì)素合成途徑中最早被研究的酶類之一，催化木質(zhì)素單體合成最后一步反應(yīng)，被認(rèn)為是木質(zhì)素形成的標(biāo)志，更是木質(zhì)素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶和調(diào)控節(jié)點(diǎn)［11］。目前，已從多種植物中克隆了CAD基因，并利用正、反義抑制和過(guò)表達(dá)等多種方法在體外對(duì)其功能進(jìn)行了研究［12-14］。在玉米bml突變株中，CAD活性下降60%～70%，木質(zhì)素含量降低近80%，G木質(zhì)素和S木質(zhì)素含量也均有下降［15］。在亞麻中抑制CAD活性，木質(zhì)素下降約40%，改變了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，果膠和半纖維素含量降低，但纖維素水平?jīng)]有發(fā)生變化［16］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】尾葉桉GLU4無(wú)性系（Eucalyptus urophyllaclone GLU4）是廣西廣泛種植的桉樹(shù)良種，其木材纖維特性適宜制漿，是紙漿材首選樹(shù)種。2014年起，廣西林業(yè)科學(xué)研究院率先在尾葉桉良種GLU4的基礎(chǔ)上開(kāi)展了木質(zhì)素合成調(diào)控的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，前期研究取得進(jìn)展，在一系列木質(zhì)素合成途徑基因中，已鎖定應(yīng)用尾葉桉肉桂酰乙醇脫氫酶（Cinnamoyl alcohol dehydrogenase，CAD）轉(zhuǎn)化煙草可抑制木質(zhì)素合成［17-18］。上述對(duì)EuCAD基因研究中是使用基因全長(zhǎng)序列構(gòu)建RNA干擾載體，序列片段較長(zhǎng)，載體構(gòu)建和應(yīng)用都不夠便捷，且容易引發(fā)脫靶效應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)RNAi技術(shù)的優(yōu)勢(shì)之一，就是利用較短的干擾片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，選取基因中的關(guān)鍵片段用于RNAi更為適宜?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用生物信息學(xué)工具對(duì)EuCAD基因進(jìn)行序列分析，根據(jù)編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分布情況，選擇EuCAD基因的部分序列構(gòu)建小片段的RNA干擾抑制表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化植物，分析干擾片段對(duì)煙草CAD基因表達(dá)和木質(zhì)素合成的調(diào)控效果，為桉樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草無(wú)菌組培苗、DH5a菌株、農(nóng)桿菌LBA4404菌株為廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

ExTaq聚合酶、RNA LA PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)于普洛麥格生物技術(shù)有限公司；SG Fast qPCR Master Mix（2×）購(gòu)自上海生工生物公司；RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、高效植物基因組提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、Universal DNA 純化回收試劑盒、離心柱型普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司；瓊脂糖、抗生素等常規(guī)試劑購(gòu)于當(dāng)?shù)厣噭┕?。引物、序列合成及測(cè)序由上海生工生物公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNAi載體構(gòu)建 利用Blastp、ProtParam、psipred、SWISS-MODEL等生物信息學(xué)軟件對(duì)EuCAD基因序列進(jìn)行分析，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的分布情況，選擇一段同時(shí)涵蓋NAD（P）結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和Zn結(jié)合催化位點(diǎn)的序列用于構(gòu)建RNAi載體。根據(jù)選定的序列，利用Vector NTI軟件分析篩選出44 bp的片段，序列為5'-gaatttg ccacagtgacattcaccagatcaagaatgatcttggcgc-3'。利用上述片段以“尾尾相連”的方式設(shè)計(jì)成反向重復(fù)序列，并在兩端附加X(jué)hoI酶切位點(diǎn)后，由上海生工生物公司合成序列，得到攜帶目標(biāo)片段的克隆載體pUC57-RNAi。

利用XhoI酶消化pUC57-RNAi，通過(guò)凝膠電泳回收得到目標(biāo)序列，同時(shí)利用XhoI酶消化pCAMBIA3301載體，同樣經(jīng)過(guò)凝膠電泳回收后，得到去除掉bar基因序列的載體骨架。將載體骨架與回收的目標(biāo)序列連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，應(yīng)用載體上的測(cè)序引物3301-F（5'-CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3'）、3301-R（5'-CGCTGAAATCACCAGTCTCTC-3'）對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)可擴(kuò)增得到目標(biāo)長(zhǎng)度片段的克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列比對(duì)，序列一致的為構(gòu)建成功的RNAi載體。RNAi載體構(gòu)建成功后，常規(guī)方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中用于轉(zhuǎn)化。

1.2.2 煙草轉(zhuǎn)化植株培育 利用攜帶RNAi載體的農(nóng)桿菌采用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過(guò)愈傷組織培養(yǎng)、芽再生培養(yǎng)階段的抗生素篩選獲得陽(yáng)性再生芽。隨機(jī)挑選陽(yáng)性再生芽，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，每個(gè)芽編號(hào)為一個(gè)株系，獲得的再生植株移栽后置于溫室內(nèi)培養(yǎng)。保留每個(gè)株系的組培繼代芽，以備后續(xù)擴(kuò)繁培養(yǎng)該株系轉(zhuǎn)基因植株之用。

移栽培養(yǎng)60 d后，取葉片提取基因組總DNA。應(yīng)用載體上的測(cè)序引物3301-F/3301-R，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)對(duì)長(zhǎng)度相符的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序以驗(yàn)證插入的RNAi序列準(zhǔn)確性。

從測(cè)序鑒定結(jié)果正確的轉(zhuǎn)基因株系中隨機(jī)挑選3個(gè)株系按照編號(hào)追溯其繼代芽，經(jīng)擴(kuò)繁后培育轉(zhuǎn)基因植株用于表型檢測(cè)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片CAD基因表達(dá)水平檢測(cè) 利用Vector NTI軟件針對(duì)內(nèi)參基因煙草actin基因設(shè)計(jì)熒光定量引物actin-F（5'-CTG GAATCCATGAGACTACTTACAA-3'）、actin-R（5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3'）。 針 對(duì)目標(biāo)基因煙草CAD（X62343.1）基因設(shè)計(jì)引物CAD-F（5'-GTATGGCACCAGAACAAGCAG-3'）、CAD-R（5'-CCAATGCCTCTTGTCTCTTCTTAT-3'）。

轉(zhuǎn)基因煙草植株移栽培養(yǎng)240 d后，自莖尖向下第3節(jié)處取葉片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用上述引物對(duì)CAD基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)株系選擇3株用于試驗(yàn)。依據(jù)基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，對(duì)調(diào)控效果最明顯的株系進(jìn)行下一步的表型檢測(cè)。

1.2.4 莖部木質(zhì)部厚度分析 參試株系取3株溫室培育270 d的煙草莖部頂端向下第4節(jié)和第6節(jié)處莖部組織，按常規(guī)方法制成石蠟切片并用番紅-固綠法染色［19］。制好的切片用Nikon研究用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，NIS-Elements軟件拍照并測(cè)量莖部直徑。測(cè)量時(shí)每個(gè)樣品選取1張切片，在莖部截面的各個(gè)方向分別采集莖部直徑數(shù)據(jù)和木質(zhì)部厚度數(shù)據(jù)60個(gè)。

1.2.5 纖維素木質(zhì)素含量測(cè)定 取溫室培育270 d的煙草植株選擇自頂端向下第3～10節(jié)莖部，去除葉片后65℃烘干24 h，粉碎后過(guò)0.425 mm篩，用于木質(zhì)素和纖維素含量檢測(cè)。木質(zhì)素含量采用酸性洗滌方法測(cè)定，參照GB/T20808-2006執(zhí)行。纖維素含量采用硝酸法測(cè)定［20］。參試株系取3株植株作為3個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi載體構(gòu)建

pCAMBIA3301載體上的測(cè)序引物3301-F/3301-R分別位于XhoI酶切位點(diǎn)旁側(cè)約50 bp處，XhoI酶切位點(diǎn)之間的bar基因序列在構(gòu)建過(guò)程中被替換為目標(biāo)序列，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度從650 bp左右縮短至約200 bp。對(duì)轉(zhuǎn)化菌落PCR鑒定結(jié)果（圖1）顯示，檢測(cè)得到擴(kuò)增出目標(biāo)特異性條帶的陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序后，結(jié)果顯示插入序列與預(yù)期序列一致，RNAi載體構(gòu)建成功，命名為pCAMBIA3301-RNAi。

圖1 RNAi載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)化菌落PCR驗(yàn)證Fig. 1 PCR validation of the transformed colony constructed by RNAi vector

2.2 煙草轉(zhuǎn)化植株培育

將重組載體pCAMBIA3301-RNAi采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，取葉片提取基因組總DNA用測(cè)序引物3301-F/3301-R進(jìn)行PCR鑒定。基因組上插入RNAi載體的轉(zhuǎn)基因植株中可以檢測(cè)到長(zhǎng)度200 bp的特異性片段，而未整合RNAi載體的植株中則擴(kuò)增不到目標(biāo)條帶。PCR鑒定結(jié)果顯示獲得了陽(yáng)性植株（圖2）。對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示序列與目標(biāo)RNAi序列一致的鑒定為轉(zhuǎn)基因植株。試驗(yàn)共獲得28個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，從中隨機(jī)挑選3個(gè)命名為R1、R2、R3，用于表型檢測(cè)。

圖2 煙草轉(zhuǎn)化苗PCR驗(yàn)證Fig. 2 PCR validation of transgenic tobacco seedling

2.3 轉(zhuǎn)基因植株CAD基因表達(dá)水平檢測(cè)

在GenBank上檢索到煙草完整CAD基因（X62343.1），將其與RNAi片段所用的44 bp序列比對(duì)，兩序列一致性達(dá)到66.7%，序列同源較高，推測(cè)其RNAi片段很可能對(duì)目標(biāo)基因引發(fā)較強(qiáng)的抑制作用。

對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株中CAD基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中CAD基因表達(dá)水平都較野生型呈現(xiàn)顯著下降（圖3），說(shuō)明轉(zhuǎn)入的RNAi片段如預(yù)期的引發(fā)了RNAi，抑制了CAD基因的表達(dá)。其中R2、R3株系中CAD基因表達(dá)分別較野生型降低67.93%和76.30%，R1株系中降幅最大、降低至野生型的12.51%，說(shuō)明該株系中調(diào)控效果最為理想，進(jìn)一步對(duì)其莖部結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素含量等表型進(jìn)行檢測(cè)。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草中基因表達(dá)水平分析Fig. 3 Analysis of gene expression level in transgenic tobacco

2.4 轉(zhuǎn)基因植株莖部解剖結(jié)構(gòu)分析

轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)狀況與野生型無(wú)異，植株葉片伸展，莖干挺直，培養(yǎng)270 d后苗高達(dá)到1.6 m左右，能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)。為研究轉(zhuǎn)入的RNAi片段是否影響煙草莖部結(jié)構(gòu)的形成，選取轉(zhuǎn)基因植株莖部第4節(jié)和第6節(jié)橫切，制成石蠟切片并染色。從表1可知第4節(jié)和第6節(jié)處莖部直徑，轉(zhuǎn)基因株系和野生型之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株莖部的生長(zhǎng)發(fā)育未受到顯著影響。對(duì)第4節(jié)和第6節(jié)處莖部的木質(zhì)部厚度測(cè)量結(jié)果顯示，在第4節(jié)處轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)部厚度較野生型顯著降低11.75%，在第6節(jié)處降幅縮小至10.06%。

表1 轉(zhuǎn)化植株莖部直徑、木質(zhì)部厚度變化Table 1 Changes in stem diameter and xylem thickness of transformed plants

2.5 纖維素木質(zhì)素含量測(cè)定

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株莖部組織中木質(zhì)素含量和纖維素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表2）顯示，轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量與木質(zhì)部厚度變化趨勢(shì)相一致，較野生型顯著降低15.26%，說(shuō)明轉(zhuǎn)入的RNAi片段起到了定向調(diào)控木質(zhì)素合成的調(diào)控效果。但轉(zhuǎn)基因植株中纖維素含量并未如預(yù)期中呈現(xiàn)補(bǔ)償性的增加，反而較野生型顯著降低10.61%。

表2 轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素、纖維素含量Table 2 Lignin and cellulose contents in transgenic tobacco

3 討論

在對(duì)目標(biāo)基因序列不甚了解時(shí)，進(jìn)行RNAi通常使用基因全長(zhǎng)序列構(gòu)建RNAi載體，這種常規(guī)的研究策略在許多植物中取得了較好的研究結(jié)果，但也有研究者提出，干擾片段過(guò)長(zhǎng)，自身復(fù)制過(guò)程中堿基錯(cuò)配幾率更高，同時(shí)較長(zhǎng)的序列更容易與其他非目標(biāo)基因序列匹配，脫靶風(fēng)險(xiǎn)更高［21］。若想選擇目標(biāo)基因的部分小片段用于RNAi，所選擇片段的位置至關(guān)重要。Holen等［22］針對(duì)目標(biāo)基因的不同位置設(shè)計(jì)4條RNAi片段用于研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種可能的位置效應(yīng)；張斌等［23］對(duì)OsPUT1基因的RNA干擾研究也提出類似的位置效應(yīng)。由此可推斷，針對(duì)目標(biāo)基因選擇RNA干擾片段時(shí)，片段在基因CDS中的位置應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎選擇。

鑒于CAD蛋白在木質(zhì)素合成中的重要功能，在許多植物中都對(duì)其進(jìn)行了基因克隆和功能研究［24-26］，到目前為止NCBI已收錄2 428條陸生植物CAD蛋白序列。不同植物中的CAD具有高度的同源性，對(duì)CAD蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有CAD都具有兩類典型的保守的結(jié)構(gòu)域：第一類是輔酶和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括NAD（P）結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)；第二類是酶活性中心結(jié)構(gòu)域，包括Zn結(jié)合催化位點(diǎn)和Zn結(jié)合結(jié)構(gòu)位點(diǎn)［27］。本研究所選序列從其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域來(lái)看，該段序列編碼蛋白兼具輔酶、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶催化結(jié)構(gòu)域，對(duì)CAD酶的催化活性影響較大。從基因序列位置分析，所選片段近于轉(zhuǎn)錄翻譯的起始端，倘若RNA干擾在此處發(fā)生，CAD酶幾乎無(wú)法轉(zhuǎn)錄或翻譯，對(duì)酶活性的抑制也將更為明顯。在將RNAi片段轉(zhuǎn)化煙草后，發(fā)現(xiàn)片段對(duì)木質(zhì)素的調(diào)控效果較為理想，從基因表達(dá)水平到木質(zhì)素含量和木質(zhì)部厚度均較野生型顯著降低，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相一致，說(shuō)明所選序列為比較理想的RNAi片段。

研究中還發(fā)現(xiàn)，植物莖部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是從上到下木質(zhì)化程度逐漸提高，而在轉(zhuǎn)基因植株中，隨著木質(zhì)化程度的提高，莖部木質(zhì)部厚度較野生型的降幅卻有所降低，通過(guò)抑制CAD基因表達(dá)調(diào)控木質(zhì)素合成的效果卻逐漸弱化。推測(cè)造成這種變化的原因可能在于CAD對(duì)木質(zhì)素合成的調(diào)控主要發(fā)生在木質(zhì)化初期，在木質(zhì)化中后期，這種調(diào)控效果被其他代謝通路中的基因應(yīng)答作用而掩蓋。同時(shí)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)部厚度的降幅均在10%左右，降幅較低，較小的降幅可能在木質(zhì)化過(guò)程中被逐漸積累的木質(zhì)部厚度稀釋，造成降幅差異逐漸不顯著。對(duì)此在后續(xù)研究中可嘗試使用底物標(biāo)記等手段，分階段解讀木質(zhì)化過(guò)程，有望深入揭示抑制CAD基因調(diào)控木質(zhì)素合成的生理生化機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究選擇了一段同時(shí)包含NAD（P）結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和Zn結(jié)合催化位點(diǎn)的CAD基因片段用于構(gòu)建RNAi載體。結(jié)果表明，在將RNAi片段轉(zhuǎn)化煙草后，轉(zhuǎn)基因植株莖部直徑與生長(zhǎng)發(fā)育與野生型無(wú)異，植株中CAD基因表達(dá)水平顯著降低，植株莖部木質(zhì)素含量與木質(zhì)部厚度均較野生型降低10%以上。本研究結(jié)果可為下一步桉樹(shù)木質(zhì)素合成調(diào)控研究提供技術(shù)參考。