SRAP技術(shù)在榆林市榆陽(yáng)區(qū)南部山區(qū)杏樹(shù)品種測(cè)定中的應(yīng)用

周飛梅，羅懷峰，朱建軍，常海濤

(1.陜西省榆林市榆陽(yáng)區(qū)林業(yè)工作站，陜西 榆林 719000；2.榆林市榆陽(yáng)區(qū)魚(yú)河林場(chǎng)，陜西 榆林 719000)

杏樹(shù)屬于薔薇科杏屬(Armenica)植物[1,2]，是我國(guó)十分重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，目前已知的品種類(lèi)型有1400多種，該樹(shù)種的果肉營(yíng)養(yǎng)豐富，味美甘甜，果仁不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，還可入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)的出口物資[3]。我國(guó)是杏樹(shù)的起源中心，該樹(shù)種耐寒，耐旱，相對(duì)于其他果樹(shù)，適應(yīng)力強(qiáng)，因此其多栽培在氣候寒冷地區(qū)，是我國(guó)北方地區(qū)特別是華北、東北、黃河流域重要的經(jīng)濟(jì)生態(tài)樹(shù)種。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)是利用正反引物直接檢測(cè)基因的可閱讀框 ORFs區(qū)域，在未知基因組序列的情況下對(duì)基因的編碼區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從而定向分析基因。該技術(shù)能有效地克服RAPD 、SSR等常規(guī)分子標(biāo)記技術(shù)中成本高、操作復(fù)雜、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、高共顯性、在基因組中分布均勻等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)在植物基因組學(xué)研究上的運(yùn)用極大彌補(bǔ)和豐富了分子標(biāo)記技術(shù)。本研究通過(guò)SRAP 分子標(biāo)記法從基因型方面對(duì)21個(gè)杏樹(shù)品種進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳多樣性分析，從分子水平上揭示榆林市榆陽(yáng)區(qū)南部山區(qū)不同杏樹(shù)品種之間遺傳差異，探討其親緣關(guān)系，為后期杏樹(shù)育種、基因定位等研究工作提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試材料

供試的杏樹(shù)共21個(gè)品種，來(lái)自陜西省榆林市榆陽(yáng)區(qū)南部山區(qū)(見(jiàn)表1)。

表1 榆陽(yáng)區(qū)杏樹(shù)新品種選育標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)比表

1.2 SRAP引物

以14優(yōu)一、15大龍王帽、16山杏、20一窩峰為試驗(yàn)材料篩選引物，從132對(duì)引物中篩選了16對(duì)引物，其中包括11對(duì)正引物，12對(duì)反引物,并委托蘇州泓迅生物科技有限公司合成(見(jiàn)表2)。

表2 SRAP 引物序列信息

1.3 主要試劑

1.0 M Tris-HCl(pH8.0)250 mL ；Tris30.3 g；無(wú)菌水200 mL ；HCl 16 mL ；0.5 M EDTA (pH8.0)250 mL；50 x TAE(p H 8.0)500 mL；TE 緩沖液(pH 8.0)500 mL；LB 培養(yǎng)基。

2 試驗(yàn)方法

2.1 擴(kuò)增反應(yīng)總體系

參考彭颯[4]等報(bào)道，PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2× TaqMasterMix (CWBIO Biotechnology Beijing Co.,Ltd.,China);引物各1.0 μL,1 μL 模板DNA，7 μL雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)程序參考 Li和Quiros[5]的標(biāo)準(zhǔn)SRAP-PCR：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，49 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃永久保存。

2.2 多態(tài)性引物篩選

利用132個(gè)引物組合對(duì)21個(gè)杏樹(shù)栽培品種進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)圖譜統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增得到每個(gè)引物的多態(tài)性條帶數(shù)，對(duì)其進(jìn)行多態(tài)性分析，并進(jìn)行21個(gè)品種的聚類(lèi)分析。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

用NTSYS-PC軟件中的SIMQUAL程序計(jì)算Jaccard遺傳相似性系數(shù)(SG)，并獲得遺傳相似系數(shù)矩陣。計(jì)算公式：SGij= 2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij指2個(gè)個(gè)體間共有的帶數(shù)，Ni+Nj指2個(gè)個(gè)體所有帶數(shù)之和。用NTSYS-PC軟件中的SAHN程序和UPGMA(unweighted pair group mean average)方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，并通過(guò)Treeplot模塊生成系統(tǒng)樹(shù)圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 電泳結(jié)果

根據(jù)本次試驗(yàn)共21個(gè)供試品種，有6對(duì)引物得到清晰的譜帶，可供分析用。

3.2 聚類(lèi)分析

根據(jù) PCR 擴(kuò)增結(jié)果，得出供試材料遺傳多樣性聚類(lèi)圖3。結(jié)果表明，21份供試材料間的遺傳相似性系數(shù)值變化范圍為0.32～0.93。其中材料1與16之間的遺傳。相似系數(shù)最小,為0.32。這表明兩種源地材料的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn);而材料8與9遺傳相似系數(shù)最大,達(dá)到0.90。說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系最近。UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,見(jiàn)圖所示,當(dāng)SG值在0.65水平上可將供試材料聚為3類(lèi)，其中供試材料1為第Ⅰ類(lèi)，供試材料7，16，17，19，20為第Ⅱ類(lèi)，剩下的供試材料為第Ⅲ類(lèi)。

4 討論與結(jié)論

從圖3聚類(lèi)分析結(jié)果來(lái)看，21個(gè)供試材料可分為三個(gè)類(lèi)群。從杏樹(shù)所處的地理位置上分析，杏樹(shù)因在其特有的氣候條件下的長(zhǎng)期栽培，而對(duì)周?chē)h(huán)境產(chǎn)生的適應(yīng)性，使得杏樹(shù)其種質(zhì)基因組相對(duì)穩(wěn)定、獨(dú)立，因此利用SRAP 對(duì)杏樹(shù)基因組進(jìn)行隨機(jī)性的PCR擴(kuò)增，可獲得大量的多態(tài)性條帶，這些條帶來(lái)自于杏樹(shù)的基因組外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域，而這些區(qū)域的多態(tài)性能夠準(zhǔn)確、真實(shí)地反應(yīng)出杏樹(shù)的種質(zhì)基因組特點(diǎn)。

根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果，第Ⅰ類(lèi)中的供試材料1號(hào)為田園選中火紅品種，其遺傳特性非常奇特，該供試材料株高明顯高于其他供試材料；而第Ⅱ類(lèi)中的7，16，17，19，20號(hào)多為優(yōu)一品種，它們之間的遺傳相似系數(shù)極高，系數(shù)區(qū)間為0.682%～93%，說(shuō)明他們親緣關(guān)系較近，與所選母樹(shù)的遺傳性狀較一致，具有較大的研究?jī)r(jià)值，可進(jìn)一步在大田中觀察研究，對(duì)其獨(dú)特性進(jìn)行發(fā)掘。其余供試材料間遺傳距離相當(dāng)，可作為對(duì)照品種進(jìn)行觀察研究。