微生物法測定腐乳中維生素B12含量的研究

（浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院鑒湖學院，浙江紹興312000）

維生素 B12（vitamin B12，VB12）也稱為鈷胺素（cobalamin），是唯一一種含有金屬元素的B族維生素。維生素B12能夠通過作為輔酶來參與蛋白質(zhì)與核酸的合成，在人體的代謝過程中發(fā)揮重要的作用[1]。維生素B12是在維持大腦正常功能中起關(guān)鍵作用的必需營養(yǎng)素，主要用于生成神經(jīng)脂蛋白并維持神經(jīng)髓鞘的生理功能，能夠提高葉酸的利用率，預(yù)防抑郁癥、老年癡呆及貧血等[2]。人體缺少維生素B12會造成脊髓變形、精神抑郁、消化道黏膜發(fā)炎，增加患心臟病的機率，是一種人體必不可少的水溶性維生素。但是，這種維生素人體不能自主合成，并且植物性食物中VB12的含量極少，人體只能通過動物性食品或藥品進行補給[3]。食品中的維生素B12通常是通過微生物代謝的方式進行合成，因此發(fā)酵食品中的維生素B12的含量較高，如泡菜、腐乳、醬油、納豆等。其中，腐乳是典型的大豆發(fā)酵制品，含有多種必需氨基酸、有機酸。通過微生物發(fā)酵，腐乳會代謝產(chǎn)生一些益生物質(zhì)，其中維生素B12是一種重要的益生成分[4]，但其在腐乳中的含量研究較少。

目前，測定維生素B12的方法主要有分光光度法、原子吸收法[5]、微生物法及高效液相色譜法[6-7]等。但是發(fā)酵食品的基質(zhì)較為復(fù)雜，利用儀器測定維生素B12的含量干擾性較大、準確性較低。而微生物法是國際上測定維生素B12含量公認的方法，主要原理是菌種在生長過程中對維生素具有特異性需求，通過選取特定菌種對其進行培養(yǎng)，并根據(jù)繁殖程度進行判斷。再通過維生素B12的含量與吸光度繪制標準曲線，計算出維生素B12的含量[8]。沈泓等[9]采用微生物法檢測食品中維生素B12的含量，結(jié)果表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。此種方法能夠準確、靈敏的測定維生素B12含量較低、基質(zhì)較復(fù)雜的樣品。因此，本試驗采用微生物法，通過萊士曼氏乳酸桿菌測定不同種類的腐乳（白腐乳、紅腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳）中維生素B12的含量，為腐乳制品中維生素B12的含量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白腐乳、紅腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳：市售；萊士曼氏乳酸桿菌（LactobacillusleichmanniiATCC7830）：上海北諾生物科技有限公司；維生素B12標準品（純度≥99%）：美國Sigma公司；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：江蘇酶聯(lián)生物科技有限公司；維生素B12測定用培養(yǎng)基：美國BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JD500-2電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；PHS-25型pH計：上海精科雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將萊士曼氏乳酸桿菌活化后轉(zhuǎn)種3代，離心棄去上清液，加入10 mL 9%生理鹽水，混勻，重復(fù)操作3次。在550 nm波長下測試菌液60%～80%的透光率，立即取1 mL測試菌液并稀釋10倍（靜置時間為0 h），在550 nm處測試菌懸液的吸光度，使其透光率在60%～80%之間。

按上述操作，測試菌懸液靜置1、2、3 h后，各吸取1 mL測試菌液并稀釋10倍后進行培養(yǎng)，并將9%生理鹽水分別換成無菌水、磷酸鹽緩沖液、維生素B12測定培養(yǎng)基，計算菌落生長數(shù)。

1.3.2 維生素B12標準溶液的制備

稱取1 mg VB12標準品，稀釋至含VB12質(zhì)量濃度分別為 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 ng/mL，在使用前120℃滅菌5 min后迅速冷卻。取1.0 mL上述標準品溶液于5 mL培養(yǎng)基，再使用滅菌水定容至10 mL，平行3份，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品處理

采用100 mL蒸餾水將1.3 g無水磷酸氫二鈉、1.0 g無水偏重亞硫酸鈉、1.2 g檸檬酸溶解，取10 mL加入一定量的腐乳樣品（白腐乳、紅腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳），加入150 mL蒸餾水并超聲振蕩處理0.5 h，而后121℃水解10 min冷卻后調(diào)節(jié)pH值至4.5，蒸餾水定容至250 mL后過濾，取濾液5 mL，加入20 mL蒸餾水，調(diào)pH值至中性并定容至100 mL。

1.3.4 樣品待測液的制備及培養(yǎng)

取 1、2、3、4、5 mL 樣品溶液于 5 mL 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，再使用滅菌水定容至10 mL。接種菌懸液（靜置1 h，維生素B12測定培養(yǎng)基）50 μL（對照組的樣品管除外）于上述培養(yǎng)管中并36℃進行培養(yǎng)36 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B12標準曲線

以維生素B12的質(zhì)量濃度為橫坐標，在波長550 nm處測定的吸光度為縱坐標繪制VB12標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 維生素B12標準曲線Fig.1 Standard curve of vitamin B12

由圖1可知，維生素B12質(zhì)量濃度為0.01 ng/mL～0.10 ng/mL時，回歸方程為y=4.162 6x+0.080 2，R2=0.994 4，線性關(guān)系良好，能夠用其計算VB12的含量。

2.2 菌懸液放置時間與培養(yǎng)菌液對菌落總數(shù)的影響

表1為在相同的試驗步驟和數(shù)據(jù)參數(shù)下，菌懸液放置不同時間和不同種類的培養(yǎng)菌液對菌落總數(shù)的影響。

表1 菌懸液放置時間與培養(yǎng)菌液對菌落總數(shù)的影響Table 1 The effect of culture medium and time of bacterial suspension on the total number of colonies

菌懸液在放置0 h時，不同種類的培養(yǎng)菌液對菌落總數(shù)的影響并不顯著，菌落總數(shù)的范圍在3.1×106CFU～4.9×106CFU。菌懸液放置1 h后，9%生理鹽水的處理組菌落總數(shù)顯示出增加的趨勢，然而無菌水和磷酸鹽緩沖溶液的處理組菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢。但是菌懸液在放置2 h后，9%生理鹽水、無菌水和磷酸鹽緩沖溶液菌落總數(shù)均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，分別降至3.4×106、0.03×106CFU 和 0.007 4×106CFU。在放置 3 h時菌落總數(shù)分別降低至 0.7×106、0.000 3×106CFU 和0.000 8×106CFU。這可能是9%生理鹽水、無菌水和磷酸鹽緩沖溶液因滲透壓的影響，并且缺少萊士曼氏乳酸桿菌所需的營養(yǎng)成分的緣故。當培養(yǎng)菌液為維生素B12測定培養(yǎng)基時，菌懸液放置時間為1 h～3 h，菌落總數(shù)均呈現(xiàn)增加的趨勢，達到8.2×106CFU～9.0×106CFU?？梢?種稀釋液中只有維生素B12測定培養(yǎng)基作為稀釋液時，菌落總數(shù)能夠處于增加并趨于穩(wěn)定。綜合考慮試驗時間的優(yōu)化，采用菌懸液放置1 h并選用維生素B12測定培養(yǎng)基作為稀釋液進行菌種的培養(yǎng)。

2.3 不同廠家腐乳中維生素B12含量分析

本試驗選取了4種不同種類的腐乳制品，其中包括紅腐乳、白腐乳、青腐乳、玫瑰腐乳，每種腐乳選取3個不同廠家的產(chǎn)品應(yīng)用微生物法測定維生素B12的含量。表2為不同廠家4種類型的腐乳中VB12的含量以及4種類型的腐乳維生素B12的平均含量。

表2 不同種類腐乳中維生素B12的含量Table 2 Vitamin B12content in different kinds of sufu

相關(guān)數(shù)據(jù)表明大豆中幾乎不含有維生素B12，但其經(jīng)過發(fā)酵后維生素B12的含量顯著增加。在本試驗中，紅腐乳中維生素 B12的含量 0.54 μg/100 g～0.76 μg/100 g之間，白腐乳中維生素B12的含量0.41 μg/100 g～0.58 μg/100 g，而青腐乳（即臭腐乳）中維生素 B12的含量為 5.12 μg/100 g～7.01 μg/100 g 之間，玫瑰腐乳中維生素 B12的含量為 3.73 μg/100 g～4.08 μg/100 g 之間?？梢?，大豆經(jīng)過發(fā)酵后都能夠合成維生素B12。曲勤鳳等[10]研究了腐乳、韓國大醬、豆豉等發(fā)酵食品，結(jié)果表明腐乳中尤其是臭腐乳的維生素B12的含量遠高于其他的發(fā)酵食品。同一類型的腐乳中維生素B12含量存在明顯的差異性，這可能是每個廠家的生產(chǎn)工藝和控制要求不同，此外在腐乳的發(fā)酵過程中選用的菌種對腐乳中維生素B12的含量也有一定的影響。萬紅芳等[11]通過對比發(fā)現(xiàn)霉菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等微生物影響著腐乳的品質(zhì)和營養(yǎng)成分。曹蕾蕾等[12]利用少孢根霉發(fā)酵腐乳，并在發(fā)酵前期使用乳酸優(yōu)化生長環(huán)境，使得腐乳中的維生素B12含量的顯著增加。

2.4 不同種類腐乳中維生素B12平均含量分析

圖2為每種腐乳3個廠家VB12的平均含量。

圖2 不同種類腐乳中維生素B12的含量Fig.2 The content of vitamin B12in different kinds of sufu

在本試驗中，紅腐乳中維生素B12的平均含量為0.63 μg/100 g，白腐乳中維生素 B12的平均含量 0.49 μg/100 g，而青腐乳（即臭腐乳）中維生素B12的平均含量為7.01 μg/100 g，玫瑰腐乳中維生素B12的平均含量為3.87 μg/100 g。4種腐乳中青腐乳的維生素B12的含量最高，可見青腐乳在發(fā)酵過程中除了分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸外，還合成了更多的維生素B12，其含量可達紅腐乳和白腐乳的10倍多（P＜0.05）。這可能因為青腐乳相對于其他類型的腐乳發(fā)酵的更為徹底，環(huán)境中能夠合成維生素B12的菌種更多，從而產(chǎn)生了更多的維生素B12。另外，玫瑰腐乳中維生素B12的含量為紅腐乳和白腐乳7倍多（P＜0.05），是因為玫瑰腐乳中玫瑰成分經(jīng)過發(fā)酵后也產(chǎn)生了較多的營養(yǎng)成分，維生素B12的含量高于紅腐乳和白腐乳。同樣，余明遠[13]通過對比玫瑰腐乳與普通腐乳中的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)玫瑰腐乳中含有較高的維生素B12，紅腐乳、白腐乳中維生素B12的含量相對較少，人體內(nèi)缺乏維生素B12時很難通過食用紅腐乳、白腐乳進行補充，且植物性食物中幾乎不含有維生素B12，素食主義者可以通過適當?shù)氖秤们喔楹兔倒甯閬硌a充人體所需的維生素B12。

3 結(jié)論

本試驗表明將菌懸液放置1 h并選用維生素B12測定培養(yǎng)基作為稀釋液利于菌種的培養(yǎng)，以紅腐乳、白腐乳、青腐乳和玫瑰腐乳這4種腐乳為研究對象，采用微生物法對其維生素B12的含量進行測定。結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的腐乳維生素B12含量存在顯著差異。4種腐乳中，紅腐乳和白腐乳中維生素B12的含量較低。青腐乳因比其他類型的腐乳發(fā)酵更為徹底而具有最高的維生素B12，是紅腐乳和白腐乳的10倍多。玫瑰腐乳中的玫瑰成分經(jīng)過發(fā)酵后會產(chǎn)生較多的營養(yǎng)成分，維生素B12的含量也較高。本文旨在為腐乳等相關(guān)發(fā)酵食品中維生素B12的研究提供試驗方法和數(shù)據(jù)參考。