微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對干貝嫩化作用的研究

王飛飛，王徐媛，楊仁迪，潘童，傅玲琳，2，王彥波，2，*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310018；2.浙江工商大學(xué)浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江杭州310018）

干貝，是由扇貝的后閉殼肌脫水干制而成，別名瑤柱、馬甲柱，甲帶子等。干貝營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)，且脂肪含量較低，風(fēng)味獨(dú)特，不僅腥味大減，還具有干貝特有的肉香味，是國際公認(rèn)的高檔水產(chǎn)品，被列入八珍之一，具有重要的使用價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]。但干貝質(zhì)地較硬，咀嚼性能較差，軟化處理繁瑣耗時，一定程度上影響其市場推廣。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）是一種催化?；D(zhuǎn)移的酶，能促進(jìn)限制性氨基酸的引入，蛋白質(zhì)交聯(lián)以及蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和溶解性的改變[2]。相較于動植物來源，微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（microbial transglutaminase，MTG）因其更容易生產(chǎn)，且具有較優(yōu)的酶學(xué)特性，如反應(yīng)最適pH值范圍廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、酶活性不依賴Ca2+、受酶抑制劑和金屬離子的影響小、底物特異性低等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，被廣泛應(yīng)用于促進(jìn)肉制品的黏結(jié)、乳制品的乳化[5-7]。但其在干貝的肉質(zhì)嫩化研究上，至今鮮有報道。

本研究通過測定質(zhì)構(gòu)特性，蒸煮損失，可溶性蛋白含量以及感官評價研究茂源鏈霉菌源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶處理的各個因素對干貝嫩度的影響，通過響應(yīng)面試驗確定最優(yōu)嫩化條件，為干貝嫩化工藝提供試驗參數(shù)，對提高干貝食用品質(zhì)及商業(yè)價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干貝：福建莆田海鮮批發(fā)中心，每粒質(zhì)量為1.5 g～3 g，置于4℃冷藏備用；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（食品級）（200 000 U/g，產(chǎn)自茂源鏈霉菌）：東恒華道生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、五水硫酸銅、碘化鉀、四水合酒石酸鉀鈉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸：國藥集團(tuán)藥業(yè)有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：天津灝洋華科生物科技有限公司；牛血清白蛋白：生工生物工程上海有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AB135-S型電子天平、DELTA 320型pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；DHG-9143BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗公司；Milli-Q超純水裝置：美國MILLIPORE公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀：美國BROOKFIELD公司；AZ8852溫度計：臺灣衡欣公司；WI1102型旋渦振蕩器：中國東西儀科技有限公司；HH系列-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：中國聚創(chuàng)環(huán)保公司；DL-1-15萬用電爐：中國泰斯特公司；Spectra Max i3型酶標(biāo)儀：美國MOLECULAR DEVICES公司；Allegra X-3012臺式冷凍高速離心機(jī)：美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

將干貝清洗干凈，挑選大小均勻且質(zhì)量為（3±0.2）g的干貝，每3粒干貝為一個試驗樣本，每個樣本質(zhì)量（9±0.5）g。

配置pH 6.0的磷酸緩沖液，將其置于50℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱備用。用pH 6.0，溫度為50℃的磷酸緩沖液配置濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液。將干貝浸沒在酶溶液中20 min，期間控制環(huán)境溫度為50℃。將酶處理后的干貝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。隨后，進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。

用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)磷酸緩沖液分別為 pH 值為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分別溶解得到0.6%谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液，并控制溫度為50℃。將干貝浸沒在酶溶液中20 min，期間控制環(huán)境溫度為50℃。酶處理完成后，將干貝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。隨后，進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。

配置 pH6.0 的磷酸緩沖液，將其置于 40、50、60、70、80℃的環(huán)境中。將干貝浸沒在0.6%酶溶液中20 min。酶處理完成后，將干貝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。隨后，進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。

1.3.2 響應(yīng)面試驗

基于單因素試驗的結(jié)果，固定嫩化時間為20 min，沸水浴時間為10 min，利用Design-Expert.8.05進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計。選取的3個因素為酶用量、pH值和溫度，對應(yīng)的響應(yīng)指標(biāo)為彈性。Box-Behnken試驗設(shè)計的因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素及水平表Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Behnken experimental design

1.3.3 感官評價

參照國標(biāo)GB/T 12310-2012《感官分析方法成對比較檢驗》[8]中規(guī)定的感官評價——成對比較檢驗流程，運(yùn)用定向成對比較檢驗方法，對嫩化后的干貝進(jìn)行感官分析。邀請30位具有一定感官品評經(jīng)驗的試驗人員組成品評小組，把試驗組和對照組的干貝樣品記編號330和550，并按照330、550的順序隨機(jī)呈遞給15位品評員，同時按550、330的順序呈遞給另外15名品評員。并要求品評員對干貝的硬度和彈性做差異性評價。

1.3.4 蒸煮損失

用電子天平分別稱量試驗組和對照組的干貝質(zhì)量，記為M1，隨后將樣品分別放入真空蒸煮袋中，沸水浴40 min[9]。取出后用濾紙吸干表面水分后，稱取蒸煮后的質(zhì)量記為M2。每組平行3次。蒸煮損失率的計算公式如下：

蒸煮損失率/%=（M1-M2）/M1×100

1.3.5 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白含量是評價肉嫩度的重要指標(biāo)[10-11]。在周丹等[12]的測定方法基礎(chǔ)上稍作修改，取嫩化后的（9±0.5）g干貝剪碎，并加入PBS緩沖液50 mL，用均質(zhì)機(jī)將干貝絞碎，攪拌均勻后倒入50 mL離心管中，在4℃下離心30 min，轉(zhuǎn)速為8 500 r/min。離心后取上清液 1 mL，并加入雙縮脲試劑（CuSO4·5H2O 4 g，KI 4.4 g，KOH 28 g，酒石酸鉀鈉 13.4 g）4 mL，在 25℃室溫下避光放置20 min。取200 μL置于96孔板中。利用酶標(biāo)儀測定波長為540nm處，樣品的吸光度值，記為A540nm。每組平行測 3 次。以 0、2、4、5、6、8、10 mg/mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.025 6x+0.071 2，R2=0.999 6。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)分析

用濾紙吸干酶處理后的干貝表面水分，通過CT3質(zhì)構(gòu)儀對其進(jìn)行彈性和咀嚼性的測定。質(zhì)構(gòu)分析條件參數(shù)[13]如下：探頭類型：TA10；預(yù)測試速度：2.0 mm/s；測試速度：1 mm/s；探頭回程速度：1 mm/s；測試距離：6 mm；觸發(fā)力：1 g；數(shù)據(jù)采集速率：100.0 points/s。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果取6次平行試驗的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 Origin 8.1、GraphPad Prism 7.00、Design-Expert 8.0.6和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶用量對質(zhì)構(gòu)特性的影響

酶用量對干貝質(zhì)構(gòu)特性的影響見圖1。

圖1 酶用量對干貝質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig.1 Effects of different enzyme doses on the texture properties of scallops

由圖1可知，當(dāng)加酶量濃度低于0.8%時，隨著谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶濃度的增加，咀嚼性不斷降低，彈性不斷增強(qiáng)，當(dāng)加酶量達(dá)到0.8%時，彈性增加約20%，咀嚼性降低25%，接著干貝彈性和咀嚼性趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，添加酶的最適濃度在0.6%～0.8%之間。由于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠催化肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與受體之間進(jìn)行酰基轉(zhuǎn)移，加強(qiáng)蛋白質(zhì)交聯(lián)，改善蛋白質(zhì)溶解性從而影響干貝的咀嚼性和彈性[14-15]，因此在底物蛋白充足時，隨著谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶濃度的增加，干貝嫩化效果提升明顯，隨后嫩化效果隨著底物逐漸交聯(lián)最終達(dá)到平衡。

2.1.2 pH值對質(zhì)構(gòu)特性的影響

pH值對干貝質(zhì)構(gòu)特性的影響見圖2。

圖2 pH值對干貝質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig.2 Effects of pH value on the texture properties of scallops

如圖2所示，隨著pH值的增加，干貝的咀嚼性逐漸減小后增大，彈性逐漸增大后減小。當(dāng)pH值達(dá)到7時，彈性達(dá)到最大，增加43%，咀嚼性達(dá)到最小，降低20%。結(jié)果表明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶嫩化干貝的最適pH值為7，這符合茂源鏈霉菌源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最適 pH 6～7 的性質(zhì)[16-18]。

2.1.3 溫度對嫩化效果的影響

溫度對干貝質(zhì)構(gòu)特性的影響見圖3。

圖3 溫度對干貝質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig.3 Effects of temperature on texture properties of scallops

由圖3可知，當(dāng)溫度在30℃～60℃之間時，干貝彈性逐漸增大，咀嚼性逐漸減小，當(dāng)溫度高于60℃時，干貝的彈性和咀嚼性則分別減弱和增強(qiáng)。結(jié)果表明，酶處理的最適溫度為60℃。該結(jié)果與孫高軍等[19]對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶最適作用溫度的探究結(jié)果基本一致。這是因為溫度的適度升高能促進(jìn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性位點(diǎn)—催化三聯(lián)體“Cys64-His255-Asp274”的暴露，但溫度過高會造成谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）以及干貝本身所含有的蛋白質(zhì)不同程度的變性，因而影響嫩化效果[20-22]。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

以谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶用量（X1）、pH 值（X2）、溫度（X3）為試驗因素，對應(yīng)的響應(yīng)指標(biāo)為彈性，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗。

響應(yīng)面試驗水平及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗水平及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

利用Design-Expert.8.05對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方程的回歸擬合，得到結(jié)果如下：Y=-0.028X1+0.15X2-0.038X3-0.042X1X2-0.05X1X3+0.18X2X3-0.27X12-0.28X22-0.22 X32+4.90

回歸方程的各因素方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variances of the developed regression model

續(xù)表3 回歸模型方差分析Continue table 3 Analysis of variances of the developed regression model

如表3所示，該模型的P＜0.05，說明該回歸模型顯著。失擬項P值為0.137 1，說明相對于絕對誤差該模型不顯著。并且，相關(guān)系數(shù)R2=0.846 9，表明該回歸模型與數(shù)據(jù)的擬合度較高，即預(yù)測的準(zhǔn)確度也相應(yīng)較高。其中，模型的 X2、X12、X22、X32的 P＜0.05，說明這幾項對于彈性增強(qiáng)的影響極為顯著。但X1酶用量，X3溫度，交互項X1X2，X1X3，X2X3對于該回歸模型影響不顯著。

各因素交互關(guān)系的響應(yīng)曲面及等高線見圖4。

圖4 各因素交互關(guān)系的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors

由圖4A可知，固定酶用量，pH值在5到7的范圍內(nèi)變化時，彈性變化較為明顯，先增大后減小。與之相比，彈性強(qiáng)度隨加酶量增加強(qiáng)度變化較小。結(jié)果表明，相同條件下pH值對于干貝嫩化的作用強(qiáng)于酶用量。等高線圖表征兩者的交互作用。如圖4B所示，改變相同的彈性強(qiáng)度，酶用量與pH值改變量基本相等，即兩者的交互作用并不明顯。方差分析中X1X2對應(yīng)的P值為0.658 8＞0.05，兩者交互作用不顯著，兩項分析結(jié)果一致。由圖4C可知，當(dāng)溫度確定時，pH值的立體圖整體趨勢更陡，且單因素方差分析結(jié)果顯示pH值的顯著性（P=0.049 3）大于酶用量（P=0.676 6）。此外，方差分析結(jié)果顯示X2X3所對應(yīng)的P值為0.05＜0.093 6＜0.1，且圖D等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明pH值與酶用量之間存在一定的交互作用。由圖4E可知，溫度與pH值的立體圖整體趨勢較為平緩，表明溫度，pH值這兩個因素對于彈性大小的影響皆不顯著。相比之下，溫度對應(yīng)的曲面更為陡峭，即溫度的影響略大。圖4F的等高線圖雖呈橢圓形，但其離心率接近1，即兩個因素的交互作用不明顯。綜上，3個因素對于彈性的影響從大到小依次為：pH值＞溫度＞酶用量。

根據(jù)多元二次函數(shù)，3個因素的一階偏導(dǎo)數(shù)?X1、?X2、?X3，進(jìn)而求得響應(yīng)值的最優(yōu)值以及此時對應(yīng)的X1、X2、X3。軟件模擬得出，當(dāng) X1為 0.58%，X2為 6.29，X3為50.42℃時，彈性值達(dá)到最大，為4.92 mm。在這個最優(yōu)條件下，做驗證試驗，得到干貝實(shí)際彈性值為（4.91±0.41）mm，與預(yù)測值4.92 mm相符。

2.3 嫩化作用驗證試驗結(jié)果

2.3.1 成對比較結(jié)果分析

干貝感官差異性結(jié)果見圖5。

圖5 干貝感官差異性結(jié)果圖Fig.5 The sensory results of scallop samples

如圖5所示，有25名認(rèn)為330樣品（試驗組）彈性更強(qiáng)，有21名認(rèn)為550（對照組）硬度更大。參考國標(biāo)GB12310-2012《感官分析 成對比較檢驗》，當(dāng)品評人數(shù)為30人，P=0.05時，其中一項被選擇多于20次，說明兩個測試樣品之間有明顯差異。結(jié)果表明，經(jīng)微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（microbial transglutaminase，MTG）在最優(yōu)條件下嫩化后的干貝與未經(jīng)任何處理干貝在彈性和硬度上能明顯被消費(fèi)者感知出差異，說明MTG酶的作用能較好地改善產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

2.3.2 理化指標(biāo)的差異性分析

理化指標(biāo)差異性結(jié)果見圖6。

圖6 理化指標(biāo)差異性結(jié)果圖Fig.6 The physical and chemical results of MTG treated samples

MTG酶的添加有效降低了干貝的蒸煮損失，減少了可溶性蛋白含量，減小咀嚼所需的力度，同時增強(qiáng)了干貝的彈性，嫩化效果顯著。這是因為谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠催化?；D(zhuǎn)移，促進(jìn)分子之間的共價鍵形成，進(jìn)而增強(qiáng)了氨基酸之間的交聯(lián)，使得游離在溶質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量降低，蒸煮損失減少[23-24]。Afshari R等[25]學(xué)者在探究MTG對小麥蛋白的作用機(jī)理時也得到了相應(yīng)的結(jié)論。再者，蛋白質(zhì)的交聯(lián)能夠促進(jìn)體系形成致密的三維結(jié)構(gòu)，類似于面制品中的面筋網(wǎng)絡(luò)，能夠改善整個體系的質(zhì)構(gòu)特性，包括彈性和咀嚼性。此外，在響應(yīng)面試驗得到的最優(yōu)條件下對干貝進(jìn)行酶處理，實(shí)際得到的干貝彈性值為（4.91±0.41）mm，與預(yù)測結(jié)果4.92 mm基本一致，再次證明回歸模型的科學(xué)性和可靠性。

3 結(jié)論

本研究基于酶用量、pH值、處理溫度3個因素，利用Box-Behnken試驗設(shè)計基于彈性指標(biāo)優(yōu)化得到微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶最佳作用條件為：酶用量0.58%，pH 6.29，溫度50.41℃?？刂泼赣昧?.58%，pH 6.29，溫度50.4℃，進(jìn)行酶處理驗證試驗，與未經(jīng)處理的干貝相比，感官品質(zhì)存在顯著差異，同時彈性提高19%，咀嚼性降低27%，蒸煮損失減少68%，可溶性蛋白含量增加38%，干貝的感官品質(zhì)得到了明顯的改善。本研究為干貝嫩化工藝提供參數(shù)，并為微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在海產(chǎn)品中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。