醫(yī)用菌株保存方法的研究
——以土壤桿菌為例

陳 璐 姚博偉 姚登明

（1、寧夏師范學(xué)院，寧夏 固原756000 2、寧夏計(jì)量質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院，寧夏 銀川750000）

可得然膠是一種重要的食品添加劑，其產(chǎn)生菌株土壤桿菌（Alcaligenes faecalis）最初是由日本的原田篤也（Tokuya Harada）教授于1964 年從土壤中發(fā)現(xiàn)的?？傻萌荒z由于具有加熱成膠的特性，也被稱為熱凝膠。日本Takeda 公司對可得然膠的食用安全性進(jìn)行了相關(guān)的研究及評價(jià)，研究結(jié)果表明可得然膠無誘變性和致癌性，食用時(shí)不會導(dǎo)致某些急性慢性疾病的發(fā)生。1989年在美國、日本、韓國及中國臺灣等國家和地區(qū)開始廣泛生產(chǎn)和使用可得然膠，并于1996 年12 月經(jīng)美國FDA 批準(zhǔn)可得然膠可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑等直接用于食品工業(yè)中，2006 年6 月我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)可得然膠作為食品添加劑應(yīng)用于食品中。

隨著我國食品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，可得然膠產(chǎn)生菌株得到了廣泛的應(yīng)用，因此該菌株的保藏是一項(xiàng)非常重要的工作。目前常用的菌種保藏方法有斜面瓊脂低溫保存、液體石蠟保存、真空冷凍干燥保存及液氮超低溫保存[1,2]，而真空冷凍干燥保存技術(shù)相較于其它保藏方法具有低溫、干燥及真空的優(yōu)良條件，能夠有效地使細(xì)胞處于基本休眠狀態(tài)，并一定程度內(nèi)抑制生長繁殖，從而降低菌種的死亡率及變異率，現(xiàn)已得到廣泛的應(yīng)用。但是如果直接用菌液凍干保存，其存活率非常低，由于保護(hù)劑可以盡可能的保護(hù)其生物活性和生理生化特性，從而減輕冷凍干燥過程中對菌體的損害[3],因此添加不同保護(hù)劑以提高凍存效率是關(guān)鍵。

本文以實(shí)驗(yàn)室保存的一株土壤桿菌714 為研究對象，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對各類保護(hù)劑進(jìn)行篩選并優(yōu)化出最佳的保護(hù)劑配方，從而最大程度地減少凍存對菌種產(chǎn)生的傷害，提高菌種的存活率，并保持良好的產(chǎn)可得然膠的性能，以期更好的應(yīng)用于食品工業(yè)中。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1.1.1 菌株

土壤桿菌（Alcaligenes faecalis）714,由華東師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH=7.2，121 °C 滅菌20 min 備用。（2）計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉；（3）保護(hù)劑溶液配制：根據(jù)質(zhì)量比配制各種保護(hù)劑溶液。

1.1.3 主要試劑與儀器

1.1.3.1 試劑：市售食品級脫脂乳粉、麥芽糊精，蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油，所用試劑均為生化級，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.1.3.2 儀器：GNP-9160 型隔水恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BL-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超低溫冰箱，遼寧瀚瓏廷生物科技有限公司；CR-21N 高速冷凍離心機(jī)，上海賽默飛生物有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，寧波新之生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程: 菌種活化→離心收集菌體→生理鹽水清洗菌體→加入不同凍干保護(hù)劑→分裝安瓿管→預(yù)凍→真空冷凍干燥→凍干菌粉→復(fù)水→活菌計(jì)數(shù)→計(jì)算存活率。

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備

從斜面上刮取一環(huán)新鮮的菌種接入到種子培養(yǎng)基中，250r/min，30℃培養(yǎng)16h，取等量種子液于無菌離心管中，10000r/min 離心5min，棄上清，菌體用無菌生理鹽水清洗兩次，10000r/min 離心5min，用等體積不同保護(hù)劑溶液重懸菌體，制成菌懸液，取樣計(jì)數(shù)，并吸取菌懸液分裝至無菌的安瓿管中，每管300ul。

1.2.3 冷凍干燥

將分裝有菌液的安瓿管置于-80℃冰箱中預(yù)凍2h，然后迅速將徹底凍結(jié)的菌液轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中，啟動凍干程序進(jìn)行抽真空干燥，冷凍干燥24h。

1.2.4 凍干前細(xì)胞總數(shù)的測定

吸取100μL 菌液用無菌水10 倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，吸取100μL 菌懸液涂布于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，每個梯度做3 個平行，將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中，30℃倒置培養(yǎng)，待菌落長出后，計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原菌懸液中的細(xì)胞總數(shù)。

1.2.5 凍干存活率的測定

向凍干后的各菌粉中加入等體積無菌水，充分溶解混勻后，梯度稀釋涂布計(jì)數(shù)，凍干后細(xì)胞存活率計(jì)算式如下：

凍干存活率（%）=每ml 菌懸液凍干后存活細(xì)胞數(shù)/凍干前每ml 菌懸液中的細(xì)胞總數(shù)X100%

1.2.6 單一保護(hù)劑的選擇

1.2.6.1 保護(hù)劑的篩選

菌株714 用種子培養(yǎng)基活化后，離心收集菌體，用各種保護(hù)劑溶液重懸菌體，真空干燥機(jī)中凍干，稀釋涂布，計(jì)算存活率。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，本文中所選用的凍干保護(hù)劑種類及濃度如表1 中所示。

表3 正交試驗(yàn)因素及水平

表1 保護(hù)劑種類及濃度

1.2.6.2 凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化

分別選取各類保護(hù)劑中保護(hù)效果最好的保護(hù)劑對其濃度進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)中所選用的保護(hù)劑種類及濃度如表2 中所示。

表2 保護(hù)劑濃度

1.2.6.3 復(fù)合保護(hù)劑的選擇

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從各大類保護(hù)劑中分別選出一種保護(hù)效果好的保護(hù)劑，利用正交設(shè)計(jì)軟件，采用L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

1.2.6.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel2013、Graphpad prism7.0 及正交設(shè)計(jì)助手II 對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑的篩選

選用糖類、醇類和大分子類共11 種常用的保護(hù)劑，考查在菌株714 凍干過程中的保護(hù)效果。從表4 結(jié)果可以看出，在糖類物質(zhì)中，海藻糖對菌體具有較好的保護(hù)效果，其存活率為36.7%，在多元醇中，山梨醇較甘油及甘露醇保護(hù)效果好，大分子物質(zhì)脫脂奶粉保存效果相對較好，綜合上述結(jié)果，選用海藻糖、山梨醇及脫脂乳粉作為凍干保護(hù)劑，進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

表4 不同保護(hù)劑對菌株凍存的影響

2.2 凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化

2.2.1 脫脂奶粉濃度優(yōu)化

圖1 為脫脂奶粉濃度對菌株凍存的影響。可以看出，脫脂奶粉對菌體具有一定的保護(hù)效果，且脫脂奶粉濃度不同時(shí)存活率也有所差異。當(dāng)脫脂奶粉濃度低于15%時(shí)，隨著脫脂奶粉濃度的增加，存活率逐漸增加；當(dāng)脫脂奶粉濃度為15%時(shí)，存活率最高，為32.5%。當(dāng)脫脂奶粉濃度大于15%時(shí)，存活率有所下降。這可能是在菌種凍存中脫脂奶粉能減少細(xì)胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的面積，同時(shí)乳清蛋白能在菌體表面形成蛋白膜，對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，并可固定凍干酶類，減少由于細(xì)胞壁損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而起到較好的保護(hù)作用[8]，另外，脫脂奶粉中含有的乳糖也能起到保護(hù)的作用[9]。

圖1 脫脂奶粉濃度對菌株凍存的影響

2.2.2 海藻糖濃度優(yōu)化

圖2 為海藻糖濃度對菌株凍存的影響。當(dāng)海藻糖濃度為4%時(shí)，保護(hù)效果最好，存活率最高為65.2%，隨著海藻糖濃度的增加，菌株存活率逐漸降低。海藻糖相較于脫脂奶粉表現(xiàn)出明顯的保護(hù)優(yōu)勢，其凍干后最高存活率可達(dá)到脫脂奶粉的近2 倍。其原因可能是海藻糖具有較大的水化體積，能競爭更多的蛋白質(zhì)水化層中的水，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為緊密，不易受到外界不利環(huán)境的影響，且在同等條件下，海藻糖顯示了最高的玻璃化相轉(zhuǎn)變溫度，表現(xiàn)出優(yōu)越的保護(hù)效果[5]，另外由于海藻糖分子較小，容易進(jìn)入蛋白質(zhì)分子的空隙中，一定程度上抑制了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，從而有效地避免了蛋白質(zhì)變性失活[10]。

圖2 海藻糖濃度對菌株凍存的影響

2.2.3 山梨醇濃度優(yōu)化

圖3 為山梨醇濃度對菌株凍存的影響。隨著山梨醇濃度的增加，菌株存活率也逐漸增加，當(dāng)山梨醇濃度為7%時(shí)，保護(hù)效果最好，存活率最高為43.9%；當(dāng)山梨醇濃度大于7%時(shí)，存活率略有下降。這可能是由于山梨醇可以和細(xì)菌的細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，一定程度上對細(xì)胞膜起到保護(hù)作用，另外還可以和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)之間形成氫鍵，穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性及相關(guān)功能特性，從而對菌體起到保護(hù)作用[11]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道山梨醇在乳酸菌凍存中也有較好的保護(hù)效果[12]。

圖3 山梨醇濃度對菌株凍存的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌種凍干保護(hù)劑

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)對保護(hù)劑的篩選，得到脫脂奶粉、山梨醇及海藻糖對菌種凍干有較好的保護(hù)效果，且最優(yōu)保護(hù)劑濃度依次為10%、7%及4%。但是單一的保護(hù)劑凍干存活率相對較低，因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑的效果。用正交設(shè)計(jì)軟件助手設(shè)計(jì)了三因素三水平L9(33)的正交試驗(yàn)，以菌株的存活率為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見表5。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由極差R 可以判斷，對菌種凍存后存活率的影響程度依次為脫脂奶粉＞山梨醇＞海藻糖。從存活率可以看出，當(dāng)組合為脫脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%時(shí)，保護(hù)效果最好，此時(shí)存活率為87.2%，大于任一單一因素的存活率，優(yōu)化效果明顯。通過表6 中的方差分析表明，脫脂奶粉的F 值大于F 臨界值，說明脫脂奶粉對菌體凍存具有顯著性的影響，因此極差分析和方差分析結(jié)果一致。

表6 顯著性分析

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，菌種在真空冷凍干燥過程中，添加保護(hù)劑對菌體存活率有很大的影響。通過單因素試驗(yàn)從糖類、多元醇類及大分子類共11 種物質(zhì)中分別篩選得到海藻糖、山梨醇及脫脂奶粉對菌株凍干有較好的保護(hù)效果，且最優(yōu)保護(hù)劑濃度依次為4%、7%及15%。正交試驗(yàn)得到土壤桿菌存活率最高的保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%，凍干后菌株的存活率可達(dá)87.2%，大于任一單一因素的存活率，優(yōu)化效果明顯。極差R 顯示，對菌種凍存后存活率的影響程度依次為脫脂奶粉＞山梨醇＞海藻糖。脫脂奶粉是一種由蛋白質(zhì)、乳糖、鹽類、維生素類等形成的混合物，由于凍干后的菌粉呈較輕的多孔無定性結(jié)構(gòu)，容易復(fù)水[11]，使其在菌種凍存中具有廣泛的應(yīng)用。脫脂奶粉單獨(dú)作為保護(hù)劑時(shí)凍干后的存活率較低，一般都是與其他保護(hù)劑復(fù)配來提高菌種凍干存活率[13]。本文也通過脫脂奶粉與其他保護(hù)劑的復(fù)配得到了保護(hù)效果良好的配方，為可得然膠產(chǎn)生菌株的保藏及工業(yè)化生產(chǎn)具有積極的作用。