鐮形棘豆總黃酮灌胃對乙型肝炎大鼠肝損傷的改善作用及其機制

趙興輝，葉柳鳳，林小田

南部戰(zhàn)區(qū)海軍第一醫(yī)院，廣東湛江524000

乙型肝炎(乙肝)是我國常見的傳染疾病，由乙型肝炎病毒感染引起，致病率高，病程長，預(yù)后差，近年來發(fā)病率逐年增高[1，2]。研究[3，4]顯示，抑制肝內(nèi)炎癥發(fā)生、減緩肝纖維化進程是乙肝臨床治療的關(guān)鍵。鐮形棘豆總黃酮是藏藥鐮形棘豆的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑菌的作用，并可降低纖維化基因的表達，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞纖維化，因而推測鐮形棘豆總黃酮可能通過抑制炎癥、緩解肝纖維化而對乙肝大鼠發(fā)揮保護作用[5，6]。TGF-β1是具有強致纖維化作用的轉(zhuǎn)化因子，可通過促進下游Smad3蛋白磷酸化，進而活化成纖維細胞，促使其合成膠原蛋白，增強纖維化，抑制TGF-β/Smad3信號，進而減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化[7，8]。在對骨肉瘤MG63細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究[9]中發(fā)現(xiàn)，鐮形棘豆總黃酮可抑制TGF-β/Smad3通路，因此推測鐮形棘豆總黃酮可能通過下調(diào)TGF-β/Smad3通路對乙肝大鼠發(fā)揮保護作用。2018年10月9日～2019年9月30日，本研究通過建立乙肝大鼠模型，觀察鐮形棘豆總黃酮灌胃對乙肝大鼠肝損傷的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠、試劑及儀器 SPF清潔級雄性SD大鼠(體質(zhì)量200～240 g)購自杭州子源實驗動物科技有限公司。乙型肝炎病毒抗原(XY-KY-1476)購自上海烜雅生物科技有限公司；鐮形棘豆(產(chǎn)自青海)購自青海優(yōu)潤堂商貿(mào)有限責(zé)任公司，其總黃酮成分(純度為26.58%)由上海友思生物技術(shù)有限公司提取分離；阿昔洛韋購自揚子江藥業(yè)；乙肝表面抗原(HBsAg)ELISA試劑盒、乙型肝炎E抗原(HBeAg)ELISA試劑盒購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；兔源GAPDH一抗、兔源纖維連接蛋白(FN)一抗、兔源四型膠原(Col IV)一抗(ab6586)、兔源TGF-β一抗、兔源Smad3一抗、兔源p-Smad3一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。全自動生化分析儀(PUZS-300)購自上海帝博思生物科技有限公司；酶標儀(XElx800)購自美國Perkin Elmer公司；凝膠成像系統(tǒng)(IBright CL 1500)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 乙肝大鼠模型制備、分組、鐮形棘豆總黃酮給予方法 參照文獻[10]以生理鹽水將乙肝病毒稀釋為1×106/mL，以10 mL/kg的劑量尾靜脈注射SD大鼠，每周注射1次，連續(xù)注射3周，然后檢測大鼠血清中ALT、AST、HBsAg及HBeAg水平，若均出現(xiàn)明顯上升，表明模型建立成功。本研究共建模63只，成功60只，隨機分為模型組、鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組，每組12只；另取12只大鼠尾靜脈注射等劑量生理鹽水，記為對照組。鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組分別以70、140、280 mg/kg的鐮形棘豆總黃酮溶液[10]進行灌胃處理，阿昔洛韋組以0.2 mg/kg的阿昔洛韋溶液進行灌胃處理，對照組和模型組以等劑量生理鹽水灌胃處理。

1.3 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST檢測 各組大鼠灌胃24 h后，經(jīng)尾靜脈取血3 mL，靜置15 min后離心收集上清，采用ELISA試劑盒檢測血清HBsAg、HBeAg水平，采用全自動生化分析儀測定大鼠血清ALT、AST水平，具體操作參照說明書進行。

1.4 各組大鼠肝組織病理形態(tài)觀察 尾靜脈取血后處死大鼠，解剖獲得肝組織，剪取約0.5 g儲存在-80 ℃冰箱中備用，剩余組織經(jīng)生理鹽水漂洗干凈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后以石蠟包埋，切片機常規(guī)病理切片，脫蠟后置于梯度乙醇中浸泡處理，使用HE試劑盒進行染色，生理鹽水漂洗1次，再次經(jīng)脫水、透明后封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理形態(tài)。

1.5 各組大鼠肝組織纖維化相關(guān)蛋白及TGF-β/Smad3通路相關(guān)蛋白檢測 取大鼠肝組織，剪碎后置于含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中，在冰浴中勻漿制備為勻漿液，4℃離心后取上清液，獲得總蛋白樣品液，BCA試劑盒測定各組樣品總蛋白濃度，取含相同質(zhì)量總蛋白的樣品液上樣，進行電泳，分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，根據(jù)目的蛋白分子量截取條帶，置于1∶1 000的兔源GAPDH、FN、Col IV、TGF-β、Smad3、p-Smad3一抗溶液中4℃孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗3次后，以1:2 000的羊抗兔二抗溶液室溫孵育2 h，再次經(jīng)TBST漂洗3次后，使用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，最后以凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶并拍照，以Quantity One軟件分析圖片，得到各目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較 ①模型組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平分別為(4 127.26±210.81)IU/mL、(53.72±10.12)IU/mL、(95.21±12.01)U/L、(83.79±11.13)U/L，對照組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平分別為(2 976.32±130.62)IU/mL、(21.16±5.11)IU/mL、(46.17±8.63)U/L、(48.96±7.01)U/L，兩組相比，P均<0.05。②各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較見表1。由表1可知，與模型組相比，鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平均降低(P均<0.05)，且鐮形棘豆總黃酮各劑量之間有劑量依賴性(P均<0.05)，鐮形棘豆總黃酮高劑量組與阿昔洛韋組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST水平比較

2.2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)比較 對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無病理損傷；模型組大鼠肝組織出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞變性壞死，數(shù)量減少，肝組織局部壞死，有炎性細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生等病理損傷；與模型組相比，鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組大鼠肝組織上述病理損傷減輕，且鐮形棘豆總黃酮各組隨劑量升高而減輕程度增強，鐮形棘豆總黃酮高劑量組與阿昔洛韋組相比，肝組織上述病理損傷減輕程度無明顯差異。

2.3 各組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量比較 ①模型組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量分別為1.35±0.23、1.03±0.17、2.12±0.48、0.83±0.12，對照組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量分別為0.13±0.04、0.07±0.02、0.12±0.02、0.06±0.01，兩組相比，P均<0.05。②各組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量比較見表2。由表2可知，與模型組相比，鐮形棘豆總黃酮低劑量組、鐮形棘豆總黃酮中劑量組、鐮形棘豆總黃酮高劑量組、阿昔洛韋組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)，且鐮形棘豆總黃酮各劑量之間有劑量依賴性(P均<0.05)，鐮形棘豆總黃酮高劑量組與阿昔洛韋組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表2 各組大鼠肝組織FN、Col IV、TGF-β、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量比較

3 討論

乙肝作為一種傳染性疾病，近年來其發(fā)病率一直高于其他類型肝炎，是臨床研究的熱點，具有重大的社會意義[13]?；颊吒腥疽倚透窝撞《竞?，病毒在體內(nèi)的復(fù)制可引發(fā)機體免疫炎癥反應(yīng)，損傷肝細胞，使反映肝功能損傷的指標血清ALT、AST水平升高，并誘導(dǎo)促纖維化因子TGF-β1表達，進而促使成纖維細胞活化、增殖，使肝組織中FN和Col IV蛋白大量合成，造成細胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致肝組織炎癥損傷及肝纖維化[14]。本研究以乙肝病毒抗原對大鼠進行尾靜脈注射，建立乙肝大鼠模型，結(jié)果顯示，建模大鼠肝組織出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝細胞變性壞死、數(shù)量減少、肝組織局部壞死、有炎性細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生等病理損傷，血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg水平及肝組織FN、Col IV蛋白相對表達量明顯升高，表明乙肝病毒抗原可引起大鼠免疫應(yīng)答，造成肝組織炎癥損傷，誘導(dǎo)肝纖維化，損害肝功能，提示模型建立成功。

乙型肝炎病毒引發(fā)的肝臟炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致肝組織損傷及纖維化的主要病理基礎(chǔ)，因而，抗炎、抗氧化是乙肝的有效治療手段。研究[14]顯示，鐮形棘豆總黃酮可降低胰島素抵抗細胞炎癥因子表達，減輕炎癥，抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的急性衰老小鼠肝內(nèi)氧化應(yīng)激，延緩TGF-β1引發(fā)的人腎小管上皮細胞纖維化[6]，表明鐮形棘豆總黃酮具有抗炎、抗氧化及抗纖維化作用。但其對乙肝大鼠是否具有保護作用，目前還未見研究。本研究以鐮形棘豆總黃酮處理乙肝大鼠，結(jié)果顯示，大鼠肝組織病理損傷減輕，血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg水平及肝組織FN、Col IV蛋白表達降低，且鐮形棘豆總黃酮各劑量之間呈劑量依賴性，表明鐮形棘豆總黃酮可減輕乙肝病毒感染，緩解炎癥損傷，降低纖維化相關(guān)蛋白表達，抑制肝纖維化，修復(fù)肝功能。

TGF-β/Smad3是調(diào)控細胞及組織纖維化的關(guān)鍵信號，上調(diào)其表達，可活化成纖維細胞，促進其增殖，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的沉積，進而增強纖維化，抑制TGF-β/Smad3信號激活，降低Smad3的磷酸化水平，可減弱肝星狀細胞的活化，緩解TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化，因而TGF-β/Smad3信號是乙肝的潛在治療靶點。本研究研究結(jié)果顯示，TGF-β/Smad3通路在乙肝大鼠體內(nèi)處于激活狀態(tài)，而乙肝大鼠經(jīng)鐮形棘豆總黃酮治療后，其肝組織TGF-β表達增強，Smad3蛋白磷酸化水平升高，臨床癥狀得到改善，表明鐮形棘豆總黃酮可能通過下調(diào)TGF-β/Smad3通路表達，進而減輕乙肝病毒感染，緩解肝內(nèi)炎癥損傷及纖維化，增強肝功能。

綜上所述，鐮形棘豆總黃酮可能通過下調(diào)TGF-β/Smad3通路蛋白表達，緩解大鼠乙肝病毒的感染，減輕肝內(nèi)炎癥及肝組織損傷，延緩肝纖維化，促進肝功能恢復(fù)，對乙肝大鼠具有一定保護作用。但本研究未以該通路抑制劑和激動劑進行對照驗證，且對其上下游信號分子也未進行充分探討，后期將深入進行相關(guān)研究。