轉(zhuǎn)染Survivin shRNA的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系凋亡、增殖及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)觀察

譚亞琦，徐文俊，何焱玲

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京100020；2 北京電力醫(yī)院

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)是非黑色素瘤皮膚癌第二常見的皮膚癌，占全世界所有皮膚癌的20%以上[1]。近年來(lái)，由于人口老齡化和紫外線暴露增加，cSCC的發(fā)病率在不斷的增加[2]。雖然cSCC的治療手段在不斷的提高，但是仍然達(dá)不到理想的療效，并且許多藥物有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，從而限制了持續(xù)的臨床反應(yīng)，導(dǎo)致cSCC患者的預(yù)后較差，需要研究新的治療方法和策略[3]。Survivin是凋亡蛋白家族(IAP)重要成員之一，也是重要的促腫瘤基因。研究[4，5]報(bào)道，在卵巢癌和胰腺導(dǎo)管腺癌等惡性腫瘤組織中Survivin表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。Survivin編碼的蛋白質(zhì)參與多種細(xì)胞信號(hào)途徑的調(diào)控，因此Survivin在細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡等生理過程和腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程中均發(fā)揮重要作用，可作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)[6]。研究[7]顯示，Survivin在cSCC干細(xì)胞樣細(xì)胞中高表達(dá)，沉默Survivin可降低角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，提示Survivin可能在cSCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。2018年2月～2019年12月，本研究觀察了轉(zhuǎn)染Survivin shRNA的cSCC細(xì)胞系凋亡、增殖及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染物及試劑 cSCC細(xì)胞系A(chǔ)431、Colo-16、SCL-1購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，永生化正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCat購(gòu)自中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)。Survivin shRNA(通過小干擾RNA技術(shù)抑制Survivin基因表達(dá)的小分子化合物)、NC shRNA(NC對(duì)照小干擾RNA)購(gòu)自中國(guó)上海吉?jiǎng)P公司?；A(chǔ)培養(yǎng)基、FBS和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒購(gòu)自上海DBI Bioscience公司，Survivin、內(nèi)參GAPDH引物購(gòu)自中國(guó)上海生工有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和蛋白上樣緩沖液購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司，MTS試劑購(gòu)自美國(guó)Biovision公司，蛋白裂解液購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκB激酶α/β(p-IKKα/β)、磷酸化p65(p-p65)一抗體和兔二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，BCA試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 cSCC細(xì)胞系A(chǔ)431、Colo-16、SCL-1和永生化正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCat中Survivin mRNA檢測(cè)及細(xì)胞選擇 取cSCC細(xì)胞系A(chǔ)431、Colo-16、SCL-1和永生化正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCat在含10%FBS培養(yǎng)基的37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)95%時(shí)，按照1∶3進(jìn)行傳代，采用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中的Survivin mRNA：采用TRIzol裂解法提取細(xì)胞中總RNA，采用Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA作為模板，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。Survivin正向引物為5′-CCGACGTTGCCCCCTGC-3′,反向引物為5′-TCGATGGCACGGCGCAC-3′；GAPDH正向引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反向引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中Survivin的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示， A431、Colo-16、SCL-1、HaCat細(xì)胞中Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為9.18±0.62、3.72±0.50、7.41±0.60、1.00±0.00，其中A431、Colo-16、SCL-1細(xì)胞中Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于HaCat細(xì)胞(P均<0.05)，且A431細(xì)胞中Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高。選取Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高的A431細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 A431細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將A431細(xì)胞分為sh-Survivin組和sh-NC組。取兩組細(xì)胞，胰酶消化后以1×105個(gè)細(xì)胞鋪至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，sh-Survivin組細(xì)胞采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染Survivin shRNA，sh-NC組細(xì)胞采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染NC shRNA，兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，采用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Survivin mRNA。結(jié)果顯示，sh-Survivin組、sh-NC組細(xì)胞中Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.04、1.00±0.01，兩組相比，P<0.05，提示Survivin shRNA成功轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞，并抑制Survivin mRNA的表達(dá)。

1.4 兩組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。取兩組細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗3次，加入4 ℃的無(wú)水乙醇固定細(xì)胞2 h，PBS洗2次，按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書加入染色緩沖液500 μL、Annexin V-FITC和PI各5 μL，常溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 兩組細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS法。取兩組細(xì)胞以每孔1 500個(gè)接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染后放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第1、2、3、4 d時(shí)，分別加入20 μL的MTS試劑，放置培養(yǎng)箱中避光2 h后，使用全波長(zhǎng)掃描儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm處的OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。

1.6 兩組細(xì)胞IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白檢測(cè) 采用Western Blotting法。取兩組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，PBS洗3次，加入蛋白裂解液，14 000 r/min離心30 min，取離心后的上清液，BCA試劑盒測(cè)得蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液于沸水中煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳80 V分離蛋白2 h，350 mA電濕轉(zhuǎn)至PVDF膜2 h，5%BSA室溫孵育PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光液、顯影液和定影液曝光蛋白條帶，采用Image J軟件檢測(cè)蛋白灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞凋亡率比較 sh-Survivin組、sh-NC組細(xì)胞凋亡率分別為19.21%±2.54%、4.52%±0.31%，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較 sh-Survivin組細(xì)胞第1、2、3、4 d時(shí)的OD值分別為0.27±0.01、0.32±0.04、0.37±0.03、0.54±0.08，sh-NC組分別為0.27±0.02、0.38±0.03、0.67±0.05和0.88±0.07，其中sh-Survivin組細(xì)胞第3、4 d時(shí)的OD值顯著低于sh-NC組(P均<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 sh-Survivin組中IκBα、p-IKKα/β、p-p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.61±0.11、0.13±0.06、0.09±0.05，sh-NC組分別為0.11±0.04、0.76±0.15、0.81±0.19，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

cSCC是一種常見的惡性皮膚癌，起源于表皮上層中分化的角質(zhì)形成細(xì)胞，對(duì)患者的生命和生存質(zhì)量有很大的影響。盡管大多數(shù)早期cSCC患者可以通過手術(shù)切除成功治療，但由于cSCC具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性高，cSCC顯示出無(wú)法控制的生長(zhǎng)，手術(shù)切除受到限制，只能選擇化學(xué)治療和放射治療。研究[8]顯示，cSCC對(duì)放射治療敏感，放療已經(jīng)應(yīng)用于完全淋巴結(jié)切除術(shù)后或不完全切除術(shù)后的輔助治療，但是伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者對(duì)放射治療不敏感。此外，cSCC具有高復(fù)發(fā)率，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是cSCC患者死亡與復(fù)發(fā)的主要原因[9]。紫外線、化學(xué)致癌物、病毒感染和免疫抑制劑等是cSCC患者發(fā)病的高危因素，尤其是紫外線輻射，它通過產(chǎn)生活性氧損害皮膚[10]。但是cSCC的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，基因的改變已經(jīng)證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11，12]，因此在分子水平探索與cSCC發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因是尋找新治療靶點(diǎn)的重要途徑。

Roberta等[7]研究報(bào)道，Survivin是角質(zhì)形成干細(xì)胞的重要標(biāo)記物，并維持腫瘤的發(fā)展、侵襲和復(fù)發(fā)，Survivin表達(dá)減少可抑制cSCC角質(zhì)形成細(xì)胞的克隆和生長(zhǎng)能力，并認(rèn)為Survivin是cSCC發(fā)育的關(guān)鍵基因。Survivin在其它惡性腫瘤中報(bào)道為促癌基因。在卵巢癌和胰腺導(dǎo)管腺癌中，Survivin抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[4，5]。研究[13]顯示，Survivin是重要的抗凋亡分子，其通過IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域與胱天蛋白酶結(jié)合而對(duì)其活化具有抑制作用，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡和保護(hù)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。此外，Survivin是染色體乘客復(fù)合物的組成部分，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)重要過程-有絲分裂紡錘體的形成，即在有絲分裂過程中準(zhǔn)確調(diào)節(jié)染色體的分離，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。因此，本研究觀察了Survivin對(duì)cSCC細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)作用的影響。

本研究首先采用qRT-PCR法檢測(cè)Survivin在cSCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與永生化正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCat相比，Survivin在cSCC細(xì)胞系A(chǔ)431、Colo-16和SCL-1中的表達(dá)顯著增加，并選擇Survivin表達(dá)最高的cSCC細(xì)胞系A(chǔ)431進(jìn)行Survivin shRNA的轉(zhuǎn)染，qRT-PCR驗(yàn)證A431細(xì)胞中Survivin表達(dá)減少后，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和MTS實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Survivin shRNA促進(jìn)A431細(xì)胞的凋亡和抑制A431細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，但其作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

Survivin是多種細(xì)胞信號(hào)的重要節(jié)點(diǎn)[5]，通過靶向Survivin，可能同時(shí)阻制了多種腫瘤信號(hào)通路。Sim等[15]報(bào)道，Survivin的一種小分子抑制劑YM155可以抑制腎透明細(xì)胞癌中NF-κB信號(hào)通路，即減少p65磷酸化表達(dá)水平，并減弱了p65/p50異二聚體的轉(zhuǎn)錄能力。NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)腫瘤的凋亡和生長(zhǎng)能力[16]，在cSCC中處于異常激活狀態(tài)[17]，p65和p50以異型二聚體的形式構(gòu)成NF-κB，在細(xì)胞質(zhì)中NF-κB與IκBα結(jié)合，處于抑制狀態(tài)，IκBα可被p-IKKα/β通過泛素化途徑降解，使得NF-κB處于游離狀態(tài)，同時(shí)p-IKKα/β可以磷酸化p65，最終導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路被激活[18]。本研究采用Western Blotting法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Survivin shRNA抑制p-IKKα/β和p-p65蛋白的表達(dá)，促進(jìn)IκBα蛋白的表達(dá)，表明Survivin shRNA可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)cSCC細(xì)胞的凋亡和降低細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

綜上所述，干擾Survivin可促進(jìn)cSCC細(xì)胞凋亡、抑制cSCC細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。Survivin可能是cSCC患者治療的潛在靶點(diǎn)。