外泌體在肺癌發(fā)病及診斷中作用的研究進(jìn)展

畢煥煥 任敦強(qiáng) 張君 王紅梅

肺癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致惡性腫瘤死亡的首位原因[1]，肺癌占所有腫瘤的21%，占所有腫瘤死亡的27%。2015年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，每年約新增加180萬例肺癌患者，死亡160萬例，其中中國(guó)貢獻(xiàn)了35.8%的新增病例和37.6%的死亡病例[2]。I期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者手術(shù)后的5年生存率高達(dá)83%，但由于缺乏早期特異性診斷標(biāo)志物[3]，大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已處于晚期，NSCLC的5年生存率不足5%。近年來肺癌的診斷方法不再局限于組織活檢，液體活檢已廣泛應(yīng)用于臨床，外泌體作為液體活檢的一種，它在癌細(xì)胞出現(xiàn)再循環(huán)之前早有分泌，且其含量及生物分子構(gòu)成存在變化[4,5]。由于外泌體受囊泡及非囊泡蛋白復(fù)合物的保護(hù)，其生物成分不易遭到破壞[6,7]，同時(shí)它還可通過激活特定的癌基因或滅活抑癌基因來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的活性[8]，故具備作為生物標(biāo)志物的穩(wěn)定性及特異性。外泌體水平與肺癌患者總生存率呈負(fù)相關(guān)[9]，有研究[10]表明外泌體直徑比臨床分期能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)可能性，可認(rèn)為是與預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?；谠\斷技術(shù)的進(jìn)步，靶向及免疫治療的臨床應(yīng)用打破了肺癌傳統(tǒng)單一的治療模式，當(dāng)前肺癌患者5年生存率已提高至15.5%[11]。本文將從外泌體表征在肺癌發(fā)生發(fā)展、診斷及預(yù)后中的作用展開綜述。

1 外泌體的概述

1984年，Harding等[12,13]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞分化時(shí)首先觀察到內(nèi)吞起源的納米囊泡的存在，這些小泡參與了網(wǎng)織紅細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的去除，研究者因此推測(cè)該囊泡在紅細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著潛在作用。這些細(xì)胞外囊泡包括外泌體、凋亡小體和微囊泡，其中凋亡小體相對(duì)容易分離，而由于外泌體的直徑在40 nm-180 nm之間，微囊泡的直徑在100 nm-1,000 nm之間[14-18]，二者的直徑范圍存在交叉，以目前外泌體分離技術(shù)很難完全徹底分離，因此國(guó)際細(xì)胞囊泡協(xié)會(huì)（International Society for Extracellular Vesicle,ISEV）允許使用外泌體代替細(xì)胞外囊泡一詞。

2 外泌體的表征

2.1 外泌體的生物起源 外泌體由不同細(xì)胞釋放，包括所有真核生物（如阿米巴變形蟲、秀麗隱桿線蟲、哺乳動(dòng)物等）及真核細(xì)胞（免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等）；外泌體也可從多種體液中分離出來，包括血漿[19]、尿液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）[20]、唾液、母乳、羊水、腹水、腦脊液、膽汁和精液等。外泌體通過內(nèi)吞作用形成早期內(nèi)吞小體，然后以內(nèi)生出芽的方式形成多個(gè)小囊泡，并選擇性地接受胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)形成晚期內(nèi)吞小體，即多泡體（multivesicular bodies, MVB）。多泡體在轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport, ESCRT）和相關(guān)蛋白的調(diào)控下[21]，一部分MVBs與溶酶體融合后降解，另一部分與質(zhì)膜融合后以外泌體的形式釋放到細(xì)胞外[22]。

2.2 外泌體的組成與功能 有報(bào)道[23]已證實(shí)，外泌體的主要成分是蛋白質(zhì)和核酸。蛋白質(zhì)可分為參與其結(jié)構(gòu)形成的結(jié)構(gòu)蛋白及作為外泌體標(biāo)記的特異蛋白，如CD9、CD63、CD81和CD82等[24]。核酸包括微小RNA（microRNA, miRNA）、DNA、信使RNA（messenger RNA, mRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）等，研究[25]表明外泌體核酸可被轉(zhuǎn)運(yùn)到鄰近或遠(yuǎn)處受體細(xì)胞產(chǎn)生生理或病理效應(yīng)，如介導(dǎo)細(xì)胞信息交流、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸遺傳物質(zhì)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。外泌體參與肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲及預(yù)后的各個(gè)環(huán)節(jié)。

3 外泌體蛋白在肺癌發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后中的作用

3.1 外泌體蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用 外泌體蛋白參與肺癌發(fā)生發(fā)展過程，包括缺氧微環(huán)境的形成、新生血管的形成及躲避宿主免疫細(xì)胞的攻擊。缺氧是腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志，缺氧本身會(huì)誘導(dǎo)炎性分子的增加，如白介素（interleukin, IL）-6、IL-1、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）和IL-10等[26]，另有外泌體熱休克蛋白-70（heat shock protein 70, HSP70）激活核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B（nuclear factor-kappa B, NF-κB）信號(hào)后，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌大量的趨化因子CCL（chemokine C-C motif ligand）-2、CCL-7、CCL-12，增加微環(huán)境中的炎性因子濃度，招募單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在腫瘤部位聚集，塑造腫瘤免疫抑制環(huán)境[27,28]。新生血管是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，該過程貫穿腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移始終。缺氧條件下腫瘤外泌體增加的同時(shí)誘導(dǎo)血管形成[29]，腫瘤來源的外泌體本身含有的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor, TGF）及激活巨噬細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）促進(jìn)血管生成[18]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是腫瘤進(jìn)展過程中血管生成及轉(zhuǎn)移形成的關(guān)鍵因素。EMT的主要特征是E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，此蛋白上調(diào)后A549肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度有所減緩，反之則A549癌細(xì)胞的遷移和侵襲增強(qiáng)[30]。有研究[31]顯示，含Rab3蛋白的外泌體過表達(dá)將會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/Akt）和糖原合成酶激酶3β（glycose synthase kinase 3 beta, GSK3β）信號(hào)通路降低E-鈣黏蛋白的水平，誘導(dǎo)EMT過程加快腫瘤進(jìn)展。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）可通過外泌體將SNAIL重組蛋白1傳遞給受體癌細(xì)胞，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤血管生成[32]。YKT6是參與外泌體產(chǎn)生與釋放的一種SNARE蛋白，阻斷YKT6后外泌體釋放減少及腫瘤轉(zhuǎn)移被抑制[33]。腫瘤進(jìn)展的另一個(gè)關(guān)鍵步驟是逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視，研究發(fā)現(xiàn)NSCLC血漿外泌體程序性死亡因子配體 （exosomal programmed cell death ligand 1, ePD-L1）作用于T細(xì)胞表面的程序性死亡因子（programmed cell death-1, PD-1）抑制T細(xì)胞的活化[34]，同時(shí)擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域使細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T-cell lymphocytes, CTLs）失活，造成CTLs免疫抑制及延長(zhǎng)癌細(xì)胞生存，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的免疫逃逸[35,36]。Poggio可通過阻斷外泌體PD-L1與PD-1的結(jié)合來提高CTLs活性、抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸及增強(qiáng)抗腫瘤作用[37]。T細(xì)胞免疫球蛋白-3（T cell immunoglobulin-3, Tim-3）是新一代的免疫檢查點(diǎn)，被其配體Galectin-9激活后可負(fù)性調(diào)節(jié)CD8/NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答[38]，NSCLC患者血漿外泌體Tim-3及配體明顯升高，且與腫瘤體積增大、進(jìn)展、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[39]。

3.2 外泌體蛋白在肺癌診斷中的作用 外泌體特異性蛋白可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物，也可反映肺癌治療效果。有研究[40]對(duì)晚期NSCLC患者和正常人血漿外泌體蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明外泌體特異性蛋白CD91在前者中顯著增加，其檢出能力也高于現(xiàn)有的生物標(biāo)志物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen, CEA），且對(duì)于外泌體的標(biāo)記性蛋白而言，CD9、CD63和CD81聯(lián)合檢測(cè)更具有特異性[41]。研究[42,43]表明NSCLC患者血漿外泌體α-2-HS-糖蛋白（alpha2-HS-glycoprotein, AHSG）、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（extracellular matrix 1, ECM1）、CD151、TSPAN8（tetraspanin 8）和CD171含量高于健康對(duì)照組；血清外泌體磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1, GPC1）、CD91、CD317在肺癌組的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組[40,44]。MUC1是由MUC1基因表達(dá)的一種高糖基化蛋白，外泌體MUC1可區(qū)分NSCLC與健康者，同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)血漿MUC1的表達(dá)水平與健康人無差異[45]，Yamashita等[46]研究出現(xiàn)類似結(jié)果，血漿外泌體表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）水平明顯高于對(duì)照組，血漿EGFR水平與對(duì)照組未見明顯差異。肺癌的免疫指標(biāo)與外泌體相關(guān)，腫瘤細(xì)胞ePD-L1一定程度上可反映腫瘤組織程序性死亡因子配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的表達(dá)水平[47]，見表1[40-47]。外泌體在肺癌患者預(yù)后評(píng)估中也有重要價(jià)值。外泌體蛋白EGFR陽性的患者對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinases inhibitor, EGFR-TKI）藥物治療有較高的客觀應(yīng)答率和較長(zhǎng)的無進(jìn)展生存期[48,49]，EGFR和P53突變者外泌體含量增加，外泌體EGFR濃度與總生存期呈負(fù)相關(guān)，濃度升高生存期縮短[50]。另有研究表明外泌體NY-ESO-1、EGFR、胎盤堿性磷酸酶（placental alkaline phosphatase, PLAP）、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）、Alix和脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding proteins,LBP）與生存期及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，其中血漿NY-ESO-1是多次實(shí)驗(yàn)后被證明與總生存期顯著相關(guān)的特異性蛋白[51,52]，血清外泌體LBP上調(diào)提示早期NSCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性大，反之亦然[52]。

表1 外泌體特異性蛋白質(zhì)在肺癌中的臨床意義Tab 1 The clinical significance of exosomal pecific proteins in lung cancer

4 外泌體miRNA在肺癌發(fā)生、發(fā)展及診斷中的作用

4.1 外泌體miRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用 miRNA表達(dá)異常與腫瘤形成、細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成有關(guān)，miRNAs作為腫瘤抑制因子或者癌基因參與腫瘤的血管生成過程[53]。研究表明外泌體通過miRNAs刺激新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)[54]，miR-210上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞中ephrinA3的表達(dá)促進(jìn)血管形成[55]，miR-9轉(zhuǎn)入內(nèi)皮細(xì)胞后降低細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）-5的水平，誘導(dǎo)JAK-STAT通路的激活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移與腫瘤血管生成[56]。外泌體miR-222-3p靶向作用于SOCS3的啟動(dòng)子增加腫瘤細(xì)胞的增殖及自身抗凋亡能力[57]，并非促進(jìn)新生血管增加的miRNA都呈上調(diào)趨勢(shì)，miNA-373、 miNA-512下調(diào)促進(jìn)腫瘤血管生成[58]。外泌體在惡性腫瘤中的作用非肺癌所特有，不同研究之間成果可相互借鑒，乳腺癌進(jìn)展期高表達(dá)的miR-660-5p已被證明在NSCLC患者外泌體和血漿中也高表達(dá)，且miR-660-5p通過靶向作用于Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）介導(dǎo)肺癌細(xì)胞分化、增殖和凋亡過程[59]。目前外泌體miRNA相關(guān)報(bào)道大部分標(biāo)本為血清或血漿，BALF是一種重要的近端生物體液，相對(duì)于肺組織活檢而言，持續(xù)BALF檢查不僅可降低肺癌的播散風(fēng)險(xiǎn)和轉(zhuǎn)移率，同時(shí)對(duì)距主支氣管較遠(yuǎn)的病變定性也有重大意義[60]。因此BALF外泌體miRNAs在肺癌早期診斷中的潛在價(jià)值引起了越來越多研究者的重視。吸煙是肺癌發(fā)生的重要因素，研究[61]證實(shí)BALF外泌體特征與吸煙密切相關(guān)，吸煙者BALF外泌體miRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變，miRNA表達(dá)譜顯示吸煙者miR-let-7e、miR-let-7g和miR-26b表達(dá)明顯減少，但尚不具備作為生物標(biāo)志物的潛力。

4.2 外泌體miRNA在肺癌診斷中的作用 外泌體miRNA可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物，也可作為反映肺癌治療效果的生物標(biāo)志物。并非所有miRNA都具備作為生物標(biāo)志物的條件，外泌體選擇性包裹某些miRNAs并通過其獨(dú)特的機(jī)制增加特定種類miRNAs的豐度[62-82]。2006年Yanaihara等[64]全基因組測(cè)序表明NSCLC患者肺組織中有12種特異性miRNAs，2009年Rabinowits等[66]證實(shí)NSCLC患者血漿外泌體miRNA譜與之一致。外泌體miRNA在肺癌患者與健康人之間存在差異，肺部不同占位性及不同病理類型之間存在差異，Rodríguez等[76]研究表明BALF和血漿外泌體特異性miRNA種類不同，見表2[65-82]。外泌體除了作為肺癌診斷的標(biāo)志物外，還可作為提示治療效果和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)可能性的生物指標(biāo)，例如，外泌體miR-222-3p靶向作用于SOCS3的啟動(dòng)子增加肺癌患者對(duì)吉西他濱的耐藥及不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)[57]。與miR-222-3p作用相反，miR-146a-5p靶向作用于自噬相關(guān)蛋白12抑制自噬過程，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，甚至可逆轉(zhuǎn)A549對(duì)化療的耐藥[83]。EGFR作為經(jīng)典突變，獲得性耐藥是縮短EGFRTKI敏感患者生存期的原因之一。miR-21誘導(dǎo)Akt磷酸化并激活相應(yīng)的信號(hào)通路，miR-21沉默表達(dá)后外泌體介導(dǎo)的Akt活化度降低，同時(shí)H827S細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性增加[84]，提示miR-21參與EGFR-TKIs的耐藥。

表2 外泌體miRNA在肺癌中的臨床意義Tab 2 The clinical significance of exosomal miRNA in lung cancer

5 總結(jié)及展望

綜上所述，外泌體源性蛋白及miRNA在肺癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用，肺癌患者早期外泌體源性蛋白、miRNA含量及表達(dá)譜區(qū)別于健康人，且不同病理類型及不同疾病間存在表達(dá)譜的差異，因此通過外泌體蛋白及miRNA的檢測(cè)有望在肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估中實(shí)現(xiàn)新的突破。但當(dāng)前外泌體研究過程中尚存在一些問題：一是外泌體的分類尚無世界范圍內(nèi)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不過近年來外泌體的分離、驗(yàn)證及保存方式在逐漸向ISEV認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)靠攏；二是外泌體特異性蛋白和miRNA作為診斷標(biāo)志物的研究日益增多，研究結(jié)果重疊的不多，但目前來看針對(duì)特定蛋白質(zhì)或者miRNA的研究增多，提示外泌體研究的廣度減小、深度增加?？偟膩碚f，外泌體在肺癌相關(guān)領(lǐng)域的研究有很大進(jìn)展空間，仍需進(jìn)行大量的研究工作促進(jìn)外泌體研究成果早日轉(zhuǎn)化。