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    白介素-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β1在煙霧暴露大鼠肺組織中的表達及與肺血管重塑的關(guān)系

    2020-08-10 06:34:38熊瑋曾玉蘭周薇
    實用老年醫(yī)學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:煙霧重塑肺動脈

    熊瑋 曾玉蘭 周薇

    有研究表明,COPD早期階段病人和沒有氣流受限的吸煙者均可發(fā)生肺血管改變[1]。肺血管重塑過程分子機制復(fù)雜,其中TGF-β1在血管張力和增殖的控制上扮演著重要角色[2]。Th17細胞是一種擁有獨立分化機制的新型 CD4+效應(yīng) T 細胞,在COPD、哮喘等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中均有重要作用。IL-17是 Th17 細胞的主要效應(yīng)因子。已有研究證明,低壓低氧可致Th17細胞在肺組織中增多,在肺血管與心肌結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要作用[3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和IL-6共同作用,誘導(dǎo)了Th17細胞的分化。Smads蛋白家族參與TGF-β1的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),其中Smad2/3是TGF-β通路信號下傳的第一個信號分子。本研究通過建立香煙煙霧暴露大鼠模型進行觀察,并進一步加入藥物干預(yù),以期探討IL-17、TGF-β1及TGF-β/Smad通路在肺血管重塑中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 清潔級健康雄性 7周齡SD大鼠72只,體質(zhì)量(210±10)g(由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所動物實驗室飼養(yǎng));CY-100B 數(shù)字測氧儀,兔抗 TLR-4 多克隆抗體、小鼠抗PCNA 單克隆抗體、PV600免疫試劑盒(武漢谷歌生物公司);奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);HMIAS-2000 彩色圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像公司)。

    1.2 實驗?zāi)P椭苽浼皠游锓纸M 參照文獻[4]制備大鼠被動吸煙裝置,煙熏箱大小為 100 cm×65 cm×45 cm,每側(cè)各留9個直徑2.5 cm的通氣孔。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d無異常后隨機分為對照組(S1組)、煙霧暴露組(S2組)、煙霧暴露+藥物干預(yù)組(S3組),每組各 24只。S1組大鼠置于小鐵籠內(nèi),自由呼吸空氣,除常規(guī)喂養(yǎng)外不做其他處理;S2、S3組大鼠在規(guī)定煙霧暴露時間內(nèi)放置于煙熏箱內(nèi),每次使用10支香煙捆扎為一組后點燃并置于煙熏箱中的支架上,香煙采用武漢市售紅金龍牌香煙,每支焦油含量為15 mg。用 CY-100B數(shù)字測氧儀進行監(jiān)測,煙熏箱中的氧濃度保持在 20%~21%之間,根據(jù)監(jiān)測結(jié)果開放煙熏箱的通氣孔;大鼠每天煙霧暴露2次,每次30 min,2次暴露時間間隔4 h。香煙煙霧暴露間隔期間將大鼠置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng),任其自由活動、飲食。同時,S3組大鼠于第5周起每次煙熏后腹腔注射Smad3抑制劑SB431542,2次/d,直至第12周。Smad3抑制劑(SB431542)以二甲基亞砜(DMSO)溶解,使用前將SB431542溶解在2%DMSO+30%聚乙二醇300+雙蒸水中,濃度為5 mg/mL,每次使用劑量為5 mg/kg,2次/d。如出現(xiàn)死亡則終止實驗。S1、S2、S3組分別于第8周、第12周隨機處死12只大鼠。

    1.3 病理標(biāo)本制作 各組大鼠到達造模時間干預(yù)點后,用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)進行麻醉,眼球取血法取血,制備血清。放血處死后開胸,分離出肺臟,取左肺用4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,行石蠟包埋,病理切片機切片,切片厚度約4μm。

    1.4 肺血管蘇木精-伊紅(HE)染色及病理學(xué)觀察 病理切片用HE染色法染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡和肺血管的病理學(xué)情況,每張切片隨機選取結(jié)構(gòu)較完整、橫斷面較圓且直徑約為50~200μm 的肺動脈 5 支,分別測量內(nèi)外徑、血管面積及管壁厚度,以圖文分析儀測量并記錄管壁面積/血管總面積(vascular wall area/total vascular area,WA%)和血管壁厚度/血管外徑(vascularwall thickness/vascular external diameter,WT%)。

    1.5 IL-17檢測 采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中IL-17表達水平,ELISA法測定血清中 IL-17 的含量。IL-17免疫組化試劑盒均由美國 Santa Cruz 公司生產(chǎn)。IL-17一抗為山羊抗大鼠 IL-17 單克隆抗體,1∶70稀釋。陰性對照均用PBS代替。染色步驟按說明書進行。以顯微鏡400倍視野下,隨機5個視野陽性染色積分光密度(IOD)均值反映IL-17表達量。

    1.6 Smad3檢測 采用免疫組化法檢測肺組織中Smad3的表達水平,用鏈霉親和素過氧化物酶 (SP)法進行。微波加熱法修復(fù)抗原,DAB顯色。試劑盒購自博士德生物制品有限公司,Smad3抗體濃度為1∶200。以5個視野IOD均值反映Smad3表達量。

    1.7 TGF-β1檢測 采用PV6000二步法免疫組化染色法檢測肺動脈組織TGF-β1的表達水平,按照試劑盒說明書進行操作,每張切片在 400 倍視野下隨機采集5條直徑100~200μm的動脈,采集圖像,測定每個視野下陽性染色動脈的吸光度(A),進行定量分析。

    2 結(jié)果

    2.1 動物的一般情況 實驗開始前,各組動物活動、飲食情況良好,活動敏捷。在整個實驗過程中未見死亡小鼠。實驗動物每日給予充足定量飼料,觀察每日飼料剩余量。與S1組比較,8 周及12周時,S2動物活動度明顯下降,反應(yīng)遲鈍、飲食量下降;S3組活動度下降,反應(yīng)遲鈍,飲食量下降,但較S2組程度減輕。

    2.2 HE染色觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變 對照組肺動脈壁較薄,結(jié)構(gòu)正常。S2組及S3組隨煙霧暴露時間延長,氣道和血管周圍炎性細胞浸潤逐漸加重,肺血管壁逐漸增厚。但未見肺氣腫改變。見圖1。

    肺血管重塑定量分析觀察指標(biāo):S1組8周與12周的WA%和WT%值無明顯差異。S2組8周和12周的WT%、WA%值均較同期S1組顯著增加,S2組12周時肺動脈壁厚度明顯大于8周時,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。S3組8周及12周時的WA%和 WT%值分別高于同期S1組,但低于同期S2組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    A:S1組8周時;B:S1組12周時;C:S2組8周時;D:S2組12周時;E:S3組8周時;F:S3組12周時 圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE染色,×200)

    2.3 各組小鼠肺動脈組織TGF-β1的表達水平比較 S1組8周及12周時肺動脈無 TGF-β1 陽性染色,S2組8周及12周時肺動脈平滑肌細胞胞漿 TGF-β1強陽性染色。S3組8周及12周時肺動脈平滑肌細胞胞漿 TGF-β1強陽性染色。見圖2。S2組8周、12周時,TGF-β1蛋白相對表達量均較同期S1組顯著增加(P<0.05),且12周時明顯高于8周亞組(P<0.05)。S3組8周及12周時TGF-β1蛋白相對表達亦明顯高于同期S1組(P<0.05),但與同期S2組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    2.4 肺組織IL-17、Smad3表達水平比較 S2組肺組織IL-17、Smad3表達水平隨煙霧暴露時間延長而增加,且較同期S1組增加,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。S3組8周及12周時,肺組織IL-17、Smad3表達較同期S2組減少,但較同期S1組增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    A:S1組8周時;B:S1組12周時;C:S2組8周時;D:S2組12周時;E:S3組8周時;F:S3組12周時 圖2 免疫組化法檢測肺動脈組織TGF-β1的表達水平(DAB 顯色,×200)

    2.5 血清中 IL-17 的水平比較 S2組血清IL-17水平隨煙霧暴露時間延長表達增加,且較同期S1組增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。S3組8周及12周時,血清IL-17水平高于同期S1組(P<0.05),但低于同期S2組(P<0.05)。見表1。

    表1 各組肺血管重塑指標(biāo)及免疫組化檢測指標(biāo)比較

    2.6 TGF-β1與WA%、WT%及肺組織IL-17、Smad3的相關(guān)性分析 肺動脈中TGF-β1表達水平與WA%、WT%(r=0.797、0.901,P<0.01)以及肺組織IL-17、Smad3(r=0.479、0.891,P<0.01)表達水平均呈正相關(guān)。

    3 討論

    肺血管重塑是肺動脈內(nèi)膜、中膜和外膜共同增厚的過程。香煙煙霧可以直接作用于肺血管,在未發(fā)生缺氧、肺功能下降和肺血管床損毀的情況下,即可引起肺血管重塑,但具體機制尚不完全明確。

    龍翔等[5]研究發(fā)現(xiàn),吸煙的COPD病人及吸煙的肺功能正常人群肺組織中的IL-17信使RNA 的相對表達量及 IL-17細胞因子均較未吸煙者增高。在對低壓低氧復(fù)制缺氧性肺動脈高壓(PAH)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn),低壓低氧后,大鼠肺組織及血清中IL-17表達水平增高,分析認為低壓低氧后,Th17細胞在肺組織中增多,導(dǎo)致肺組織 IL-17水平增高,IL-17可以刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞表達內(nèi)皮細胞黏附分子1等黏附分子,并能增強血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等生長因子的促增殖作用,共同參與肺血管重塑[3]。IL-17能募集及活化中性粒細胞,促進T細胞活化及刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生細胞因子,從而介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng),促進新生血管的生成[6]。IL-17是 Th17 細胞的主要效應(yīng)因子。Th17細胞的分化需要TGF-β信號的參與。

    TGF-β1具有重要的免疫調(diào)節(jié)和致纖維化活性,故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位[7]。其存在于所有的哺乳動物中,上皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞等細胞都能夠合成并釋放TGF-β1。研究表明,在炎癥反應(yīng)明顯的COPD大鼠中,其肺小動脈的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞TGF-β1表達增高[2]。吸煙也可以導(dǎo)致大鼠氣道上皮細胞 TGF-β1表達明顯升高,而且香煙煙霧刺激時間越長,TGF-β1表達越多[8]。

    本實驗通過建立煙霧暴露大鼠肺血管重塑模型,經(jīng)HE染色觀察到煙霧暴露后各組大鼠肺血管都發(fā)生了不同程度的炎癥浸潤及管壁變形、增厚,管腔狹窄等,其中以吸煙 12周的小鼠血管的改變最為明顯。通過計算血管重塑的客觀指標(biāo)(WA%和WT%),證實肺血管重塑隨煙霧暴露時間延長而逐漸加重,肺血管重塑程度與煙霧暴露時間呈正比。而隨煙霧暴露時間延長,大鼠肺組織及血清中IL-17表達亦增高,肺組織中Smad3表達增加,與肺動脈組織中TGF-β1表達呈正相關(guān);肺動脈組織中TGF-β1表達增高,與肺血管重塑水平呈正相關(guān)。表明IL-17、Smad3、TGF-β1在肺血管重塑中起重要作用。在一項對COPD病人的研究中同樣發(fā)現(xiàn),COPD病人的血清、肺泡灌洗液中IL-17的含量均明顯增高,表明IL-17可能在COPD的病理進程中發(fā)揮重要的作用[9]。加入Smad3抑制劑進行干預(yù)后,肺血管組織中TGF-β1未明顯減少,但血清IL-17及肺組織中IL-17明顯減少,肺血管重塑程度較同期S2組減輕,表明在IL-17、TGF-β1參與的肺血管重塑過程中,TGF-β/Smad3通路起重要作用。

    TGF-β發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)主要依賴于其下游高度保守的胞內(nèi)信號蛋白-Smads蛋白家族介導(dǎo)的信號傳遞,TGF-β通過激活其受體的Smad2和Smad3,聯(lián)合核轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。作為TGF-β1的下游信號,Smad3是參與 COPD發(fā)病的關(guān)鍵性細胞因子。野百合堿PAH模型大鼠肺動脈中,TGF-β1、磷酸化Smad3 蛋白表達明顯升高,Smad3 磷酸化水平顯著增高,證實在PAH大鼠肺動脈中TGF-β/Smad3信號通路呈顯著活化狀態(tài),參與大鼠PAH的發(fā)生發(fā)展過程[10]。SB431542為特異性ALK5抑制劑,即TGF-β受體Ⅰ的抑制劑,可以抑制ALK5激活對下游信號分子Smad2/3的磷酸化,從而阻斷依賴Smad 途徑。本次實驗表明,使用SB431542能減少IL-17表達,減輕肺血管重塑程度。但肺血管重塑發(fā)病機制復(fù)雜,可能有多種信號通路參與其中,Smad信號通路是其中途徑之一。在肺纖維化發(fā)病機制中,TGF-β1 還可能誘導(dǎo)非Smad信號通路。

    綜上所述,煙霧暴露大鼠肺組織中IL-17、肺血管組織中TGF-β1表達明顯增高,通過多種途徑參與肺血管重塑過程,其中Smad3在促進IL-17表達及肺血管重塑中起重要作用,SB431542通過阻斷TGF-β/Smad通路可能減輕肺血管重塑程度,可能為今后COPD、肺血管疾病的治療提供方向。但本研究未對SB431542的使用劑量進一步探討,使用抑制劑的不良反應(yīng)需長期觀察。而且IL-17參與肺血管重塑可能存在多種途徑,仍需進一步研究。

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