3類(lèi)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查平臺(tái)檢測(cè)胎兒染色體微缺失微重復(fù)效果分析

張春花 賀權(quán)澤 喬龍威 吳小娟 陸嘉逢 薛 瑩 沈 聰 王 挺

江蘇省蘇州市立醫(yī)院(215000)

染色體微缺失微重復(fù)(CNV)綜合征可引起一系列復(fù)雜多樣的臨床癥狀[1]。目前臨床上至少發(fā)現(xiàn)了70種疾病與這類(lèi)綜合征相關(guān)，其中90%～95%患者由新發(fā)引起；5%～10%患者由家族性遺傳引起[2]。目前沒(méi)有有效治療手段，通過(guò)產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前檢測(cè)可盡早發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。隨著基于高通量測(cè)序技術(shù)的唐氏綜合征無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)廣泛應(yīng)用[3-5]，適用范圍逐步擴(kuò)大至檢測(cè)母體外周血中胎兒的染色體微缺失微重復(fù)[6-7]。本研究對(duì)不同NIPT平臺(tái)篩查胎兒CNV的檢測(cè)性能進(jìn)行比較分析，探索各平臺(tái)檢測(cè)性能差異原因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

對(duì)2018 年1月-2018 年10 月本院普通NIPT篩查樣本實(shí)施CNV篩查。

1.2 篩查方法

孕周>12周孕婦簽署知情同意書(shū)后，取10ml 外周血行NIPT。NIPT采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)母血中游離DNA 進(jìn)行低覆蓋度全基因組測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序結(jié)果中的DNA序列片段進(jìn)行重復(fù)序列去除和GC含量校正，將獲得的unique reads與每條染色體進(jìn)行比對(duì)并計(jì)算每條染色體的unique read數(shù)目，計(jì)算胎兒trisomy21，trisomy18，trisomy13 風(fēng)險(xiǎn)，其他常染色體三體風(fēng)險(xiǎn)，性染色體異常風(fēng)險(xiǎn)以及胎兒染色體微缺失微重復(fù)分析[8]。疑似胎兒染色體微缺失微重復(fù)陽(yáng)性病例轉(zhuǎn)至優(yōu)生優(yōu)育門(mén)診就診，醫(yī)生向孕婦解釋NIPT 結(jié)果，建議羊膜腔穿刺，并對(duì)后續(xù)的染色體核型以及基因芯片結(jié)果進(jìn)行解釋。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1按不同的測(cè)序儀,本實(shí)驗(yàn)室有DA8600、CN500、BGI500 3類(lèi)NIPT平臺(tái)。母體外周血中游離DNA的高通量測(cè)序具體操作按照各平臺(tái)儀器試劑要求進(jìn)行，DA8600 Sequencer(Life Technologies)，CN500 sequencer(Illumina)。

1.3.2羊水細(xì)胞染色體核型分析將羊水細(xì)胞接種至含羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(Chang Amnio,杭州歐亞生物技術(shù)有限公司)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)8～9 d后，常規(guī)收獲制片并染色體 G 顯帶及核型分析。

1.3.3基因芯片檢測(cè)使用美國(guó)Affymetrix 公司CytoScan750K 芯片進(jìn)行CNV檢測(cè)，雜交信息采用Affymetrix Chromosome Analysis Suite 3.0 軟件進(jìn)行分析。

1.3.4隨訪通過(guò)病歷及電話等對(duì)參加NIPT篩查孕婦進(jìn)行妊娠結(jié)局跟蹤。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同測(cè)序平臺(tái)測(cè)序儀質(zhì)控參數(shù)

因血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)，有介入性產(chǎn)前診斷禁忌證或自愿選擇NIPT的孕婦共計(jì)23170例，分別在3個(gè)檢測(cè)平臺(tái)行NIPT檢測(cè)，DA8600 7430例、CN500 12446例、BGI500 3294例。BGI500 Sequencer(BGI)相應(yīng)的質(zhì)控參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 不同測(cè)序平臺(tái)測(cè)序儀質(zhì)控參數(shù)

2.2 胎兒染色體微缺失微重復(fù)篩查概況

3類(lèi)測(cè)序平臺(tái)完成普通NIPT檢測(cè)同時(shí)行染色體微缺失微重復(fù)篩查。篩查陽(yáng)性患者給予輔助報(bào)告共79份，詳見(jiàn)表2。陽(yáng)性篩查率DA8600平臺(tái)為0.38%(28/7430)，CN500平臺(tái)為0.26%(32/12446)，BGI500平臺(tái)為0.58%(19/3294),各平臺(tái)間有差異(P=0.019)。對(duì)輔助篩查患者建議選擇羊水細(xì)胞染色體核型分析或基因芯片診斷，其中DA8600平臺(tái)9名孕婦、CN500平臺(tái)1名孕婦、BGI500平臺(tái)4名孕婦拒絕。以具有基因芯片結(jié)果樣本計(jì)算，DA8600平臺(tái)CNV檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為4/15,CN500平臺(tái)3/18,BGI500平臺(tái)6/14，3類(lèi)測(cè)序平臺(tái)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值未見(jiàn)差異(P=0.108)。此外，假陽(yáng)性樣本所占比例DA8600平臺(tái)為11/15,CN500平臺(tái)為15/18,BGI500平臺(tái)為8/14,3個(gè)平臺(tái)的假陽(yáng)性率未見(jiàn)差異(P=0.254)。

表2 各測(cè)序儀CNV篩查結(jié)果

2.3 基因芯片結(jié)果分析

基因芯片診斷47個(gè)樣本，CNV<5Mb樣本 7個(gè)，5Mb～10Mb樣本2個(gè),CNV>10Mb樣本5個(gè),其中有1個(gè)樣本含有兩個(gè)CNV。34個(gè)樣本經(jīng)由基因芯片分析診斷為染色體未見(jiàn)明顯異常(對(duì)照組)?；蛐酒Y(jié)果診斷為有CNV的13個(gè)樣本中(見(jiàn)表3)，孕婦平均年齡28.5歲(20～41)歲和平均孕周17.7周(16.3～19.7周)與對(duì)照組相比無(wú)差異(P>0.05)；孕婦體質(zhì)量指數(shù)(BMI)平均20kg/m2(18.3～24.4kg/m2)與對(duì)照組有差異(P=0.03)。在13個(gè)確診CNV的樣本中，10個(gè)樣本血清學(xué)篩查結(jié)果異常，異常包括臨界風(fēng)險(xiǎn)、高風(fēng)險(xiǎn)、mom值異常。根據(jù)基因芯片的診斷結(jié)果，本研究中NIPT能夠篩查的胎兒CNV為650kb～95Mb，位置分布于染色體2,8,9,12,14,15,16,18,22,X上。

2.4 各個(gè)平臺(tái)CNV檢測(cè)效能差異分析

將3個(gè)平臺(tái)各項(xiàng)質(zhì)控參數(shù)實(shí)際值進(jìn)行比較，包括有效數(shù)據(jù)量、測(cè)序讀長(zhǎng)、GC%、Q20(%)、比對(duì)率(%)，重復(fù)率(%)、胎兒濃度(%)，發(fā)現(xiàn)各測(cè)序平臺(tái)的有效數(shù)據(jù)量具有差異。有效數(shù)據(jù)量DA8600測(cè)序儀為3.94±0.76,CN500為3.58±0.44,BGI500為6.61±1.19,BGI500高于DA8600和CN500(P<0.001)。

2.5 隨訪

對(duì)NIPT提示CNV高風(fēng)險(xiǎn)且進(jìn)行基因芯片診斷的47例樣本隨訪結(jié)果分析，DA8600平臺(tái)經(jīng)基因芯片診斷為未見(jiàn)明顯異常的11例中8例出生嬰兒未見(jiàn)明顯異常，3名孕婦尚未分娩，基因芯片結(jié)果診斷為CNV的4例中，1例胎兒攜帶Dup Xp22.2q23(95Mb)的孕婦繼續(xù)妊娠，新生兒篩查苯丙酮數(shù)值偏高未復(fù)查，其他正常。1例攜帶Dup14q21.3q24.1(18.21Mb)的胎兒已被引產(chǎn)。1名胎兒攜帶Dup2q32.2q32.3(2.488Mb)的孕婦和1名胎兒攜帶Dup12q21.31(1.93Mb)的孕婦繼續(xù)妊娠還未分娩。CN500平臺(tái)基因芯片結(jié)果診斷為未見(jiàn)明顯異常的15例樣本中，1例因胎兒B超異常引產(chǎn)，1例胎兒股骨偏短3周繼續(xù)妊娠，2例因無(wú)人接聽(tīng)隨訪電話失訪，4名孕婦繼續(xù)妊娠還未分娩,7例嬰兒出生后健康；基因芯片結(jié)果診斷為CNV異常的3例中，1例攜帶Del 9p21.1(1.038Mb)胎兒出生后無(wú)肉眼可見(jiàn)異常，1例攜帶Dup22q11.1q13.33(36.24 Mb)的胎兒被引產(chǎn)，1例攜帶Dup 2p12(1.34 Mb)的胎兒繼續(xù)妊娠還未分娩。BGI500平臺(tái)經(jīng)基因芯片結(jié)果診斷為未見(jiàn)明顯異常的8例樣本中，4例提示健康嬰兒出生，4例還未分娩；基因芯片診斷為CNV異常的6例中，1例攜帶Dup 2q35q36.3(9.18Mb，骨骼發(fā)育異常)的胎兒和1例攜帶Dup14q24.3q32.2(21.843Mb，畸形)的胎兒已引產(chǎn)，其余4例繼續(xù)妊娠還未分娩。

3 討論

NIPT平臺(tái)對(duì)T21,T18,T13篩查加權(quán)檢出率和假陽(yáng)性率分別為99.2%和0.09%[9]。2012年以來(lái)，普通NIPT被陸續(xù)用于CNV篩查[6，10-11]。Liu等[6]報(bào)道，NIPT對(duì)胎兒染色體微缺失微重復(fù)的陽(yáng)性篩查率為4.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為73.6%。Li等[12]研究，NIPT對(duì)胎兒染色體微缺失微重復(fù)的陽(yáng)性篩查率為9.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為61.1%。本研究中3類(lèi)平臺(tái)中BGI500的陽(yáng)性篩查率(0.6%)高于其他兩個(gè)平臺(tái)，但低于上述研究結(jié)果；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(42.9%)與其他兩個(gè)平臺(tái)沒(méi)有顯著差異，低于上述報(bào)道。分析這種差異可能原因：上述研究選取為因胎兒異常超聲、母親高齡而行NIPT篩查，本文選擇的是特定時(shí)間內(nèi)所有參加NIPT篩查人群。

本文基因芯片結(jié)果CNV陽(yáng)性組BMI指數(shù)低于未見(jiàn)異常組，即BMI指數(shù)高者CNV檢測(cè)假陽(yáng)性率更高，這可能與高BMI指數(shù)群體中孕婦DNA對(duì)胎兒DNA的稀釋效應(yīng)有關(guān)，該稀釋效應(yīng)通過(guò)降低胎兒DNA濃度影響測(cè)序平臺(tái)對(duì)胎兒CNV的檢測(cè)效能[14]。Lo等報(bào)道，特定測(cè)序平臺(tái)NIPT對(duì)CNV的檢出能力與4個(gè)因素相關(guān)，即CNV的大小和位置，胎兒DNA濃度，unique read number[13]。證實(shí)unique read number越大，對(duì)CNV的檢出性能越好。本文分析發(fā)現(xiàn)BGI500平臺(tái)的unique read number平均值高于其他兩個(gè)平臺(tái)，篩查陽(yáng)性率也高于DA8600平臺(tái)和CN500平臺(tái)，與上述文獻(xiàn)結(jié)論一致。此外，本研究NIPT篩查出的陽(yáng)性樣本在診斷過(guò)程中，羊水核型分析<5M的CNV結(jié)果均未顯示異常，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。因此如果不考慮診斷染色體上DNA片段易位倒位等異常，針對(duì)NIPT篩查結(jié)果顯示<5M的CNV，選擇基因芯片或其他分辨率更高的診斷方法更合理。

隨訪結(jié)果分析，并非所有的CNV均可致病或嚴(yán)重致畸致殘。CNV根據(jù)臨床意義可定義為良性、可能良性、可能致病、病理性[14]。對(duì)一例胎兒攜帶Del 9p21.1(1.038Mb)(可能致病CNV)的隨訪發(fā)現(xiàn)，嬰兒出生后健康。另外有報(bào)道沒(méi)有T21、T18、T13、性染色體異?；駽NV異常者，隨訪仍有一定比例孕婦因B超結(jié)果異常而引產(chǎn)，或不明原因流產(chǎn)，可能與CNV或他染色體異常的漏篩相關(guān)[16]。因此，相較于T21,T18,T13篩查，普通NIPT應(yīng)用于胎兒CNV篩查時(shí)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，假陰性假陽(yáng)性率較高，在遺傳咨詢(xún)中醫(yī)生應(yīng)充分告知孕婦。結(jié)合2016年相關(guān)指南要求[10]，NIPT適用于CNV篩查時(shí)，除了應(yīng)告知孕婦假陰性、假陽(yáng)性可能，應(yīng)建議CNV特別是致病性CNV篩查陽(yáng)性的孕婦應(yīng)進(jìn)行診斷檢查。

綜上所述，用于T21,T18,T13產(chǎn)前篩查的普通NIPT對(duì)CNV具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，提高測(cè)序平臺(tái)unique read number將是提高CNV篩查效能的一個(gè)方向。醫(yī)生在遺傳咨詢(xún)過(guò)程中應(yīng)充分告知孕婦普通NIPT在CNV篩查上的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及可能出現(xiàn)的假陰性或假陽(yáng)性情況。CNV篩查陽(yáng)性者需通過(guò)產(chǎn)前診斷才能確診胎兒是否攜帶染色體微缺失微重復(fù)，對(duì)確診的CNV需充分告知CNV致病性及其外顯率和表型差異以便孕婦做出更合理選擇。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和成本降低，改進(jìn)后的NIPT平臺(tái)將以更好的CNV篩查效能服務(wù)于產(chǎn)前檢查。