紫心甘薯轉(zhuǎn)錄因子bHLH的基因克隆及功能研究

惠亞可，胡敏倫，郭晉雅，高 峰

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是旋花科甘薯屬根莖類一年生草本植物，為世界第七大農(nóng)作物，也是我國廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物之一. 我國甘薯栽培面積達(dá)660萬hm2，產(chǎn)量為1億t，占世界甘薯總產(chǎn)量的70%[1]. 紫心甘薯是甘薯中一個具有獨(dú)特遺傳性狀的品種類型，其塊根中因含有十分豐富的花色素苷而呈深紫色[2]. 花色素苷是植物類黃酮合成途徑的有色末端產(chǎn)物，而由紫心甘薯提取的花色素苷色彩鮮艷，并且具有較好的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性. 同時，紫心甘薯花色素苷還具有抗氧化、清除自由基、降血糖、降血脂、抑制腫瘤、護(hù)肝、抗菌等多種藥理功能[3-4]. 因此，紫心甘薯可作為提取安全無毒天然色素的優(yōu)質(zhì)原料.

bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子，是真核生物中廣泛存在的一個較大的轉(zhuǎn)錄因子家族，因其具有保守的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(Basic-Helix-Loop-Helix)結(jié)構(gòu)域而得名. bHLH結(jié)構(gòu)域由約60個氨基酸構(gòu)成，其中包括2個功能區(qū)域：一是堿性區(qū)域，負(fù)責(zé)與DNA的結(jié)合，其在多肽鏈的N 端，并含有大量堿性氨基酸，由大約15個氨基酸組成，其中有6個共有的氨基酸殘基；二是HLH 區(qū)域，分布在C 端，主要由疏水氨基酸殘基構(gòu)成，其中含有既親水又親脂的α-螺旋，2個α-螺旋之間被不同長度的連接區(qū)(環(huán))分開，形成螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，利于HLH 之間相互作用形成二聚體. bHLH 轉(zhuǎn)錄因子通常通過形成同二聚體或異二聚體與靶基因啟動子的不同部位相結(jié)合，從而對基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用[5-6].

紫心甘薯的特殊性在于其富含花色素苷的部位為深埋地下的塊根，參與塊根中花色素苷合成調(diào)控的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控靶標(biāo)尚不很清楚. 在甘薯屬植物中，已克隆獲得了R2R3類MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因IbMYB1，并證實(shí)了IbMYB1基因的表達(dá)與甘薯塊根中花色素苷的合成密切相關(guān)，且對CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、3GT等花色素苷合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因具有調(diào)控作用[7]. 然而，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子是否也參與了紫心甘薯的花色素苷合成調(diào)控，其調(diào)控方式如何尚不明確. 因此，本論文擬對bHLH類轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行分析，研究其對紫心甘薯花色素苷合成中的調(diào)控作用，將有助于深入了解紫心甘薯花色素苷合成的分子調(diào)控機(jī)制，為在分子水平上明確紫心甘薯塊根特異性合成和積累花色素苷的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用試材為紫心甘薯品種“山川紫”、品系“A5”和白心甘薯品種“禺北白”. 此3個甘薯品種(系)各組織的著色特征具有明顯差異，其中“山川紫”塊根呈紫色；“A5”塊根為深紫色；而“禺北白”的塊根為白色. 所有材料均采自于華南師范大學(xué)生物園.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA和DNA的提取 RNA的提取參照北京百泰克生物技術(shù)有限公司的多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒的操作步驟. 從最后所得的RNA溶液中吸取2 μL總RNA，使用Nano Drop ND1000 微量測定分光光度計進(jìn)行RNA濃度測定和純度鑒定；同時吸取5 μL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度(電泳相關(guān)試劑均使用RNase Free-H2O 配置). DNA是按照植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物公司)進(jìn)行提取.

1.2.2 RACE克隆技術(shù) 以紫心甘薯“山川紫”塊根的總RNA為模板，以表1中F/R引物擴(kuò)增，使用PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分離目的基因的保守片段. 按照SMART RACE cDNA amplification user mannul手冊進(jìn)行甘薯5’-cDNA與3’-cDNA的合成. 根據(jù)目的基因的保守序列設(shè)計2個特異的反向引物R1和R2(巢式PCR 用)，采用5’-RACE技術(shù)擴(kuò)增目的基因5’端的序列. 同時設(shè)計2個特異性正向引物F1和F2，擴(kuò)增目的基因3’端的序列. 再分別以特異引物F1/R1，F(xiàn)2/R2和通用引物UPM組合，進(jìn)行第1輪和第2輪PCR反應(yīng). RACE所用引物見表1.

表1 RACE 引物使用表Table 1 The RACE primer use table

1.2.3IbbHLH1和IbbHLH2的生物信息學(xué)分析 使用Vector NTI Advance 11軟件和BLAST工具 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對本文克隆得到的序列進(jìn)行比對分析. ORF(Open Reading Frame)的查找和核苷酸序列的翻譯應(yīng)用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html 網(wǎng)站的ORF Finder工具完成. 使用Expasy(http://www.expasy.ch/tools/)上ProtParam工具進(jìn)行蛋白生化性質(zhì)(包括相對分子量、等電點(diǎn))的預(yù)測. 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析應(yīng)用http://www.expasy.ch/tools/上SPOMA軟件完成.IbbHLH2蛋白質(zhì)三維模型則采用Swiss-Model同源建模軟件進(jìn)行預(yù)測(http://swissmodel.expasy.org/)，并用Weblab ViewLite 4.0 軟件進(jìn)行分析. 使用CLUSTAL W(1.82)軟件對目的序列進(jìn)行多重比對以后，再使用MEGA 3軟件中的鄰位相連法(Neighbor-Joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建[8-10].

1.2.4 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位 使用pBEGFP載體進(jìn)行真核表達(dá)構(gòu)建. 以“山川紫”3’-cDNA作為模板，分別擴(kuò)增2條帶有不同酶切位點(diǎn)末端的IbbHLH1和IbbHLH2的ORF序列. 分別將pBEGFP+IbbHLH1和pBEGFP+IbbHLH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，并進(jìn)行PCR鑒定. 將pBEGFP+IbbHLH1和pBEGFP+IbbHLH2質(zhì)粒分別導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，瞬時表達(dá)后，觀察IbbHLH1和IbbHLH2蛋白的亞細(xì)胞定位. 亞細(xì)胞定位的方法步驟參照XU等[11].

1.2.5 RT-PCR 對于RT-PCR，從“禺北白”、“山川紫”和“A5”的根、莖和塊根中提取總RNA. 以2 μL DNA為模板，使用PrimeScript，取數(shù)據(jù)的平均值. org/orf/gorf試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果. PCR反應(yīng)條件為:(1)50 ℃ 30 min；(2)94 ℃ 2 min；(3)94 ℃ 30 s；(4)55 ℃ 30 s；(5)72 ℃ 2 min；(6)72 ℃ 10 min；(7)16 ℃ Forever. 其中(3)到(5)進(jìn)行36個循環(huán)數(shù). 所用RT-PCR引物如表2，其中G14為內(nèi)參[12].

表2 甘薯半定量RT- PCR引物使用表

2 結(jié)果與分析

2.1 紫心甘薯IbbHLH1 和IbbHLH2 全長cDNA 的克隆及序列特征分析

2.1.1IbbHLH1和IbbHLH2全長cDNA 的克隆 采用RT-PCR的方法克隆得到了bHLH家族的成員IbbHLH1和IbbHLH2的核心序列. 其中IbbHLH1核心序列長1 066 bp；IbbHLH2核心序列長1 200 bp. BLAST同源比對分析顯示:上述2段序列與旋花科該類基因的同源性均高達(dá)93%，說明此2段序列是甘薯IbbHLH的保守片段. 根據(jù)巢式PCR獲得IbbHLH1和IbbHLH2的全長cDNA序列，其堿基序列及其編碼的氨基酸序列分別見圖1和圖2，其長度分別為2 516 bp和2 304 bp，將其在Genbank中進(jìn)行登錄，登錄號分別為：KC708871和JF508437.

采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF Finder工具對IbbHLH1和IbbHLH2的全長cDNA序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明:IbbHLH1的全長cDNA序列中包含一個長為1 878 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼625個氨基酸；其5’-UTR的長度為453 bp，3’-UTR的長度為185 bp，具體位置見圖1.IbbHLH2ORF長度為2 004 bp，編碼667個氨基酸；其5’-UTR的長度為117 bp，3’-UTR的長度為183 bp，具體位置見圖2.

圖1 “山川紫”IbbHLH1的全長cDNA 序列及其編碼的氨基酸序列

圖2 “山川紫”IbbHLH2 的全長cDNA 序列及其編碼的氨基酸序列

2.1.2IbbHLH1和IbbHLH2推導(dǎo)的氨基酸序列的多重比對分析 采用Vector NTI Advance 11軟件對IbbHLH1和IbbHLH2蛋白與其他植物來源的bHLH1及bHLH2家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析，結(jié)果表明：不同物種來源的bHLH家族蛋白的氨基酸序列基本上是保守的，但在紫心甘薯中某些氨基酸序列存在較大變異(表3、表4).

表3 IbbHLH1進(jìn)化保守的氨基酸序列

表4 IbbHLH2進(jìn)化保守的氨基酸序列

IbbHLH1與同為旋花科的野薯ItabHLH2(Ipomoeatrifida，登錄號EU192093)的同源性高達(dá)95.1%；與旋花科的三色牽牛ItrbHLH2(Ipomoeatricolor，登錄號EU192088)同源性為93.8%；與茄科的矮牽牛PhJAF13(Petuniahybrida，登錄號AF020545)的同源性為49.1%；與十字花科的擬南芥AtGL3和AtEGL3(Arabidopsisthaliana，登錄號NM_148067和NM_001198373)的同源性分別為41.4%和40.6%；與禾本科的玉米ZmB和ZmP(Zeamays，登錄號NM_001112236和M26227)的同源性分別為31.2%和30.3%(表3).

IbbHLH2與同為旋花科的月光花IabHLH2(Ipomoeaalba，登錄號EU192097)的同源性最高，為82.7%；與旋花科的圓葉牽牛IpbHLH2(lpomoeapurpurea，錄號EU032619)同源性為82%；與茄科的矮牽牛PhAN1(Petuniahybrida登錄號AF260919)的同源性為51.1%；與十字花科的擬南芥AtTT8(Arabidopsisthaliana，登錄號NM_117050)的同源性為38.4%(表4).

IbbHLH1和IbbHLH2氨基酸序列中均含有典型的bHLH保守結(jié)構(gòu)域. 在IbbHLH1中,bHLH結(jié)構(gòu)域由第421位氨基酸到第477位氨基酸組成，其中包括14個進(jìn)化保守的氨基酸位點(diǎn)(表3);在IbbHLH2中,bHLH結(jié)構(gòu)域由第465位氨基酸到第523位氨基酸組成，其中包括17個保守的氨基酸位點(diǎn)(表4). 上述結(jié)果表明了本文克隆獲得的IbbHLH1和IbbHLH2為植物bHLH基因家族的成員.

另外，將IbbHLH1和IbbHLH2編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)二者的同源性僅為28.9%. 其中較為保守的區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域以及N-端前200 個氨基酸的區(qū)域；而差異最大的區(qū)域位于N-端200個氨基酸之后至bHLH結(jié)構(gòu)域之間的位置. 上述結(jié)構(gòu)的差異表明IbbHLH1和IbbHLH2蛋白可能具有不同的功能.

2.1.3IbbHLH1和IbbHLH2的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 選取其他物種中具有bHLH結(jié)構(gòu)且與花色素苷合成代謝途徑相關(guān)的基因，通過ClustalX軟件和MEGA 3.1軟件[9]，采用鄰位相連(Neighbor-Joining，NJ)的方法[13]構(gòu)建了IbbHLH1和IbbHLH2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3). 由圖3可見，該進(jìn)化樹能較好地反應(yīng)各基因的進(jìn)化關(guān)系.IbbHLH1與IbbHLH2分別可以歸屬到bHLH1、bHLH2的大分支中；另外，IbbHLH1和IbbHLH2分別與同為旋花科的三色牽牛(Ipomoeatricolor)和圓葉牽牛(Ipomoeapurpurea)的親緣關(guān)系最近. 表明IbbHLH1和IbbHLH2分別為植物IbbHLH1和IbbHLH2基因家族的成員.

圖3 IbbHLH1和IbbHLH2基因NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

2.1.4 IbbHLH1和IbbHLH2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測與亞細(xì)胞定位 SOMPA分析IbbHLH1和IbbHLH2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，顯示α-螺旋是其主要結(jié)構(gòu)基元，其保守的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的三維模型的分析結(jié)果表明：IbbHLH1和IbbHLH2具有bHLH蛋白家族典型的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，并且保守的氨基酸位點(diǎn)主要分布于其中的螺旋區(qū)域.

將IbbHLH1-EGFP和IbbHLH2-EGFP導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)，在OLYMPUS OptiGrid熒光顯微鏡下觀察融合蛋白IbbHLH1-EGFP和IbbHLH2-EGFP瞬時表達(dá)產(chǎn)生的綠色熒光信號(圖4). 由圖4可見:未侵染的洋蔥表皮細(xì)胞由于沒有目的蛋白存在，因此在488 nm的藍(lán)光激發(fā)下只有細(xì)胞壁有微弱的自發(fā)熒光，而侵染35S∶∶IbbHLH1-EGFP+LBA4404和35S∶∶IbbHLH2-EGFP+LBA4404農(nóng)桿菌后的洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中均可看到明顯的綠色熒光信號，說明IbbHLH1和IbbHLH2蛋白均定位于細(xì)胞核中.

圖4 洋蔥表皮細(xì)胞中IbbHLH1-EGFP和IbbHLH2-EGFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位

2.2 不同品種中IbbHLH1、IbbHLH2及花色素苷合成相關(guān)基因的表達(dá)特征

分析紫心甘薯品種“山川紫”、品系“A5”和白心甘薯品種“禺北白”各塊根IbbHLH1和IbbHLH2的表達(dá)模式，同時分析其他花色素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和3GT)的表達(dá)模式. 結(jié)果(圖5A、B)顯示：在塊根中，除IbbHLH1外，其他基因的表達(dá)模式均與各品種(系)塊根的著色特征一致，IbbHLH2與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量從高到低依次為A5、山川紫、禺北白(圖5B). 上述結(jié)果推測：IbbHLH2可能參與甘薯塊根中花色素苷合成途徑一系列酶基因的表達(dá)與調(diào)控，而IbbHLH1可能與紫心甘薯花色素苷的合成無關(guān).

圖5 不同品種(系)甘薯塊根中各基因的表達(dá)量

3 討論

根據(jù)同源克隆的原理，本研究從紫心甘薯中克隆獲得了2個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因，分別命名為IbbHLH1(GenBank 登錄號：KC708871)和IbbHLH2(GenBank 登錄號：JF508437). 對于上述2個基因是否屬于bHLH蛋白家族的成員，本文根據(jù)ATCHLEY等[5]提出的標(biāo)準(zhǔn)來鑒定. ATCHLEY應(yīng)用運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)的手段，分析了242種生物中的bHLH蛋白，提出了bHLH家族成員的判斷標(biāo)準(zhǔn). 本文在IbbHLH1的bHLH結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)14個進(jìn)化保守的氨基酸位點(diǎn)(表 3)；在IbbHLH2中也找到共17個保守位點(diǎn)(表4). 上述結(jié)果符合ATCHLEY提出的標(biāo)準(zhǔn)，因此可以判定IbbHLH1和IbbHLH2均屬于bHLH 家族成員. 典型的轉(zhuǎn)錄因子含有核定位信號功能區(qū)域，使其能進(jìn)入細(xì)胞核，與結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)控序列結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能. 進(jìn)一步證實(shí)IbbHLH1和IbbHLH2蛋白均定位于細(xì)胞核中,與轉(zhuǎn)錄因子的核定位特征一致，確定本文獲得的IbbHLH1和IbbHLH2是轉(zhuǎn)錄因子基因.

目前,研究者已對花色素苷的合成代謝途徑及其相關(guān)調(diào)控因子在模式植物中進(jìn)行了大量的研究. 研究表明：花色素苷的合成是由一系列結(jié)構(gòu)基因編碼的酶催化完成的，而這些結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平受到轉(zhuǎn)錄因子在不同時空上的組合調(diào)控[14-16]. 參與花色素苷生物合成途徑調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要包括3大類：MYB、bHLH和WD40. 這3類轉(zhuǎn)錄因子可單獨(dú)作用調(diào)控花色素苷合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，也可形成蛋白復(fù)合體共同調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而控制花色素苷在植物中的積累模式[17].

bHLH類轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中廣泛存在的一個較大的轉(zhuǎn)錄因子家族[5-6]. 目前，研究得最清楚的影響花色素苷生成的調(diào)節(jié)基因是玉米Lc(leafcolour)基因和CL(colorless)基因[18]. 研究[19]發(fā)現(xiàn)：Lc基因?qū)FR、F3’5’H、ANS、UF3GT的激活作用較強(qiáng)，對花色素苷合成途徑起到重要影響. 繼玉米Lc基因被克隆以后，在其它植物中先后發(fā)現(xiàn)了編碼bHLH 蛋白的基因，例如調(diào)控金魚草花冠顏色的Delila基因[20]，調(diào)控矮牽?；ㄉ腁N1基因和B-Peru基因[21-22]，以及在茄子果皮和果肉中均有表達(dá)的SmGL3和SmTT8基因[23]等，這些調(diào)節(jié)基因均調(diào)控花色素苷合成途徑下游的關(guān)鍵酶[24].

前人的研究發(fā)現(xiàn):bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育以及花色素苷的合成代謝中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用. 目前已從玉米、擬南芥、牽牛、甜橙、大麗菊等多種植物中分離獲得了調(diào)控花色素苷生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因. 參與花色素苷合成調(diào)控的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族成員，依據(jù)其進(jìn)化特征可分為2類：bHLH1和bHLH2.然而，不同種屬的植物中,參與花色素苷調(diào)控的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族成員有所不同，并且其對花色素苷合成的調(diào)控模式也存在差異.

在矮牽牛中存在2種編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的基因(AN1和B-Peru)，前人將二者分別命名為bHLH2和bHLH1[15,21]. 在同屬旋花科的日本牽牛(Ipomoeanil)、圓葉牽牛(Ipomoeapurpurea)和三色牽牛(Ipomoeathicolor)中也分別克隆獲得了bHLH2和bHLH1基因[22-23].bHLH1和bHLH2基因的表達(dá)均與牽?；ㄖ谢ㄉ剀盏姆e累相關(guān)，在深紫色的牽?；ㄖ卸呔罅勘磉_(dá)，在淺粉色花中二者的表達(dá)量均明顯下降，而在白色花中bHLH1的表達(dá)量繼續(xù)下降但仍有表達(dá)，而bHLH2的表達(dá)量接近于零，說明bHLH2基因?qū)颗；ㄉ剀盏暮铣删哂懈雨P(guān)鍵的調(diào)控作用.在旋花科植物圓葉牽牛中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因IpIVS(IpbHLH2)能夠調(diào)控花色素苷合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)的作用，對DFR-B和ANS的調(diào)控作用最為明顯，在bHLH2表達(dá)缺陷型的植株種皮中，DFR-B和ANS的表達(dá)量幾乎為零[25]. 本文分析了IbbHLH1、IbbHLH2及花色素苷合成酶基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和3GT)在3個甘薯品種(系)的塊根中的表達(dá)量，結(jié)果表明：在塊根中，除IbbHLH1外，IbbHLH2與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式一致，且與各品種(系)塊根的著色特征一致，即IbbHLH2與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量從高到低依次為A5、山川紫、禺北白(圖5B). 上述結(jié)果推測：IbbHLH2可能參與甘薯塊根中花色素苷合成途徑一系列酶基因的表達(dá)與調(diào)控，而IbbHLH1可能與紫心甘薯花色素苷的合成無關(guān).

后續(xù)試驗(yàn)可根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步采用實(shí)時熒光定量PCR 的方法測定IbbHLH2與另外2個花色素苷合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子IbMYB1和IbWD40，以及花色素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和3GT)在不同品種(系)甘薯的塊根及根的不同發(fā)育時期的基因表達(dá)量. 進(jìn)一步驗(yàn)證是否IbbHLH2基因的表達(dá)與花色素苷的合成積累是同步的，是否IbbHLH2基因是紫心甘薯花色素苷合成代謝中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因. 這將有助于對認(rèn)識bHLH的功能奠定基礎(chǔ). 深入了解紫心甘薯花色素苷合成的分子調(diào)控機(jī)制，為在分子水平上明確紫心甘薯塊根特異性合成和積累花色素苷的研究奠定基礎(chǔ).