lncRNA SNHG14通過miR-217-5p/FHIT分子軸抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力

魯帥奇 楊凌博 秦帥鋒 張寒 孫建濤

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院泌尿外科（河南洛陽471009）

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其惡性程度較高，具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)［1］。傳統(tǒng)的治療如手術(shù)治療、化療等在近十幾年有了較大的發(fā)展，然而膀胱癌患者整體的預(yù)后仍然較差［2］?；蛩降陌邢蛑委熓前螂装┭芯康闹匾较?。長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的單鏈RNA 分子，由于缺少有效的開放閱讀框或包含高密度的終止子，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，長期以來被認(rèn)為是沒有生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物［3］。研究［4］表明，lncRNA 可在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層次調(diào)控基因的表達(dá)。越來越多的lncRNA 被證實(shí)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要調(diào)控作用，lncRNA 已成為膀胱癌研究領(lǐng)域新的熱點(diǎn)［1］。lncRNA SNHG14 是一個新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。有研究［5］表明，SNHG14 在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)明顯降低，高表達(dá)SNHG14 可明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。SNHG14 在膀胱癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探究SNHG14 在膀胱癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，觀察高表達(dá)SNHG14 對膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及其分子作用機(jī)制，以期為膀胱癌的基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本選取本院泌尿外科于2016年11月至2019年2月行膀胱癌根治性手術(shù)切除的癌組織和相應(yīng)的癌旁組織75 例，于液氮中冷凍保存，標(biāo)本均經(jīng)本院兩名以上病理科專家確診?；颊咂骄挲g（54.43±8.32）歲，術(shù)前均未行放化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會同意且患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞與主要試劑正常膀胱上皮細(xì)胞（SVHUC-1）和膀胱癌細(xì)胞株（J82、T24、5637、BIU-87）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM/F12 培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。SNHG14高表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。Transwell 小室購自美國康寧公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen 公司。Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司。熒光實(shí)時定量PCR（qPCR）試劑盒購自天根生化科技有限公司。二抗購自武漢博士德生物有限公司。噻唑藍(lán)（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。ECL 顯影液購自美國Thermo 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染J82、T24、5637、BIU-87細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，SV-HUC-1生長于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以對數(shù)生長期的BIU-87 細(xì)胞為對象，利用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒和SNHG14高表達(dá)質(zhì)粒，定義為對照組和實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后，更換新鮮的RPMI-1640 培養(yǎng)基。

1.4 RNA 提取和熒光實(shí)時定量PCR提取75 例膀胱癌組織和細(xì)胞株的總RNA，采用超微量分光光度計檢測每個樣品在260 nm 和280 nm 波長處的分光度值，將RNA（二者比值在1.8～2.0 之間）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)試劑盒說明書配制qPCR 反應(yīng)體系。以U6 為內(nèi)參檢測miR-217-5p 的表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參檢測SNHG14 和FHIT mRNA 的表達(dá)。SNHG14 上游引物為5′-CGTTGTCGAAAGCTAAAAGGA-3′，下游引物為5′-TGTTTCCATCTCACCAAATGC-3′；miR-217-5p 上游引物為5′-GGATGACGTAGTCCTTGA-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；GAPDH 上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；FHIT 上游引物為5′-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3′，下游引物為5′-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3′；U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min，62 ℃25 s，72 ℃25 s，35 個循環(huán)，得到Ct 值。獲得的Ct 值采用2-ΔΔCt方法計算基因表達(dá)量。

1.5 MTT 檢測BIU-87 細(xì)胞增殖將轉(zhuǎn)染后的BIU-87 細(xì)胞胰酶消化后接種于96 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于接種后的第1、2、3、4、5天，每孔加入15 μL 濃度為5 g/L 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加二甲基亞砜200 μL，振蕩15 min。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測定每組細(xì)胞在450 nm 波長處的光密度（OD）值。

1.6 Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測BIU-87 細(xì)胞侵襲將轉(zhuǎn)染后的BIU-87 細(xì)胞胰酶消化后接種于預(yù)鋪Matrigel 膠的Transwell 上室，每組均設(shè)4 個復(fù)孔。加 入600 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基至Transwell 下室。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell上室，采用多聚甲醛室溫下固定10 min，采用0.1%結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min，采用棉簽輕輕擦去殘留細(xì)胞。高倍顯微鏡下拍照、計數(shù)，進(jìn)入下室的細(xì)胞量代表細(xì)胞侵襲情況。

1.7 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測SNHG14 作用的分子機(jī)制采用LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測SNHG14可互補(bǔ)結(jié)合的miRNA，采用miRTarBase 軟件預(yù)測miRNA 可互補(bǔ)結(jié)合的基因。

1.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測FHIT蛋白的表達(dá)量將轉(zhuǎn)染后的BIU-87 細(xì)胞胰酶消化、離心收集后，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白。檢測蛋白濃度后根據(jù)其濃度調(diào)節(jié)上樣量，于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到NC 膜。將膜置于5%脫脂牛奶封閉，進(jìn)一步置于一抗FHIT（1∶1 500稀釋）、PI3K（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶1 500 稀釋）、p-AKT（1∶2 000）、mTOR（1∶2 000）及α-Tubulin（1∶500）在4 ℃下孵育過夜。洗膜后在二抗中孵育2 h。滴加ECL 顯影液顯影，α-Tubulin 為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG14 在膀胱癌組織和細(xì)胞株中低表達(dá)qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，SNHG14 在75 例膀胱癌組織中的表達(dá)量與癌旁組織相比明顯下降［（1.16±0.32）vs.（5.07±0.77），P=0.003］，見圖1；與正常膀胱上皮細(xì)胞相比，SNHG14在膀胱癌細(xì)胞株（J82、T24、5637、BIU-87）中的表達(dá)量明顯下降（均P＜0.001），其中在BIU-87 細(xì)胞中表達(dá)最低，見圖2。

圖1 SNHG14 在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量Fig.1 Expression level of SNHG14 in bladder cancer and adjacent tissues

2.2 轉(zhuǎn)染SNHG14 表達(dá)質(zhì)粒促進(jìn)BIU-87 細(xì)胞中SNHG14 表達(dá)轉(zhuǎn)染SNHG14 表達(dá)質(zhì)粒后48 h，qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組BIU-87 細(xì)胞中SNHG14 表達(dá)量與對照組相比明顯增加［（12.65±1.46）vs.（1.00±0.05），P＜0.001］。

2.3 高表達(dá)SNHG14 抑制BIU-87 細(xì)胞的增殖MTT檢測結(jié)果顯示，在第3、4、5天，高表達(dá)SNHG14的實(shí)驗(yàn)組BIU-87細(xì)胞OD值明顯低于對照組（P=0.040、0.023、0.010），表明高表達(dá)SNHG14 可抑制BIU-87細(xì)胞的增殖能力。見圖3。

圖2 SNHG14 在膀胱癌細(xì)胞株和正常膀胱上皮細(xì)胞中的表達(dá)量Fig.2 Expression level of SNHG14 in bladder cancer cell lines and normal bladder epithelial cell

圖3 高表達(dá)SNHG14 對BIU-87 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of over expression SNHG14 on the proliferation of BIU-87 cells

2.4 高表達(dá)SNHG14 明顯抑制BIU-87 細(xì)胞的侵襲Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組BIU-87細(xì)胞穿過底膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組［（85.03±10.41）vs.（26.37±7.69），P=0.004］，表明高表達(dá)SNHG14可抑制BIU-87 細(xì)胞的侵襲能力，見圖4。

2.5 生物信息學(xué)軟件預(yù)測SNHG14 作用的分子機(jī)制采用LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測顯示，SNHG14 可互補(bǔ)結(jié)合miR-217-5p；miRTarBase 軟件預(yù)測顯示，miR-217-5p 可互補(bǔ)結(jié)合FHIT mRNA，見圖5。

2.6 高表達(dá)SNHG14對BIU-87細(xì)胞中miR-217-5p和FHIT mRNA 表達(dá)的影響qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組BIU-87細(xì)胞中miR-217-5p mRNA表達(dá)量明顯低于對照組［（0.19±0.02）vs.（1.01±0.07），P＜0.001］，F(xiàn)HIT mRNA 表達(dá)量明顯高于對照組［（5.71±0.64）vs.（1.00±0.03），P＜0.001］，表明高表達(dá)SNHG14 可下調(diào)miR-217-5p 的表達(dá)，促進(jìn)FHIT mRNA 的表達(dá)。

圖4 高表達(dá)SNHG14 對BIU-87 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of overexpression SNHG14 on the invasion of BIU-87 cells

圖5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測SNHG14 作用機(jī)制Fig.5 Bioinformatics technology predicts the mechanism of action of SNHG14

2.7 高表達(dá)SNHG14 對FHIT 蛋白表達(dá)的影響Western Blot 檢測結(jié)果顯示，高表達(dá)SNHG14 后，F(xiàn)HIT 蛋白表達(dá)量增加，PI3K/AKT 信號通路蛋白如PI3K、p-AKT 及mTOR 蛋白表達(dá)降低，提示PI3K/AKT 信號通路被抑制，見圖6。

3 討論

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，lncRNA 已成為近年來非編碼RNA 研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［6］。lncRNA可通過多種方式調(diào)控基因的表達(dá)，廣泛參與原癌基因或抑癌基因的上調(diào)或下調(diào)，在細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡、衰老等各種生理病理活動中均具有非常重要的調(diào)控功能［7］。lncRNA 在惡性腫瘤中的差異表達(dá)和分子作用機(jī)制研究逐漸深入，越來越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］。已有一些lncRNA如ITGB1、UCA1、DUXAP10被證實(shí)在膀胱癌中發(fā)揮作用，可明顯影響膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、耐藥性等惡性生物學(xué)行為，且與膀胱癌的早期診斷、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷具有相關(guān)性［9-11］。SNHG14 是一個新發(fā)現(xiàn)的具有抑癌基因功能的lncRNA，可通過調(diào)控miRNA 的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，SNHG14 在膀胱癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)量均明顯降低，表明SNHG14 可能在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用［5］。本研究進(jìn)一步通過MTT法和Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)SNHG14 可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。

圖6 高表達(dá)SNHG14 對BIU-87 細(xì)胞FHIT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of high-expressed SNHG14 on the expression of FHIT protein and related proteins in BIU-87 cells

lncRNA 在腫瘤中作用機(jī)制之一是“分子海綿”作用，即通過競爭性結(jié)合miRNA 并下調(diào)miRNA 的表達(dá)，干擾miRNA 對其靶基因的抑制作用［12］。生物信息技術(shù)預(yù)測顯示，SNHG14 可互補(bǔ)結(jié)合miR-217-5p，miR-217-5p 可互補(bǔ)結(jié)合脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidine teiad，F(xiàn)HIT）。miR-217-5p在皮膚鱗狀細(xì)胞癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中明顯高表達(dá)，正向調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮明顯的原癌基因作用［13-14］。本研究結(jié)果顯示，高表達(dá)SNHG14 后，膀胱癌細(xì)胞中miR-217-5p 的表達(dá)明顯降低，SNHG14 可能通過“分子海綿”作用下調(diào)miR-217-5p 的表達(dá)。FHIT 基因位于染色體3q14.2，由147 個氨基酸殘基組成，是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。FHIT 在胃癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)HIT 通過抑制PI3K/AKT 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其表達(dá)水平與腫瘤患者的預(yù)后明顯相關(guān)［15-18］。FHIT 在膀胱癌組織和細(xì)胞株中呈低表達(dá)，且FHIT 表達(dá)水平與膀胱癌的轉(zhuǎn)移、分期、分級相關(guān)，F(xiàn)HIT 的表達(dá)水平越高，患者生存期越長［19］。本研究結(jié)果顯示，SNHG14 抑制miR-217-5p 的表達(dá)后，F(xiàn)HIT 基因的表達(dá)明顯增加，表明SNHG14 可能通過靶向抑制miR-217-5p 的表達(dá)，促進(jìn)FHIT 基因的表達(dá)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BIU-87 細(xì)胞中FHIT 蛋白表達(dá)升高后，PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白PI3K、p-AKT 及mTOR 表達(dá)明顯降低，提示PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制。

綜上所述，本研究顯示SNHG14在膀胱癌中表達(dá)明顯降低，高表達(dá)SNHG14 可降低膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其分子機(jī)制可能是抑制miR-217-5p 的表達(dá)后促進(jìn)FHIT 基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步阻滯PI3K/AKT 信號通路。SNHG14 可能為膀胱癌的分子治療提供新的靶點(diǎn)。