地塞米松對大鼠心肌梗死后巨噬細胞極化及心功能的影響

宋吉哲 劉成林 杜愛玲

1濰坊醫(yī)學院內(nèi)科學教研室（山東濰坊261000）；2濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科（山東濰坊261031）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)生后，梗死區(qū)域隨即出現(xiàn)中性粒細胞滲入，之后便有單核巨噬細胞的浸潤，并在AMI 后的炎癥反應和組織修復中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞中M2 亞型巨噬細胞通過產(chǎn)生抗炎調(diào)節(jié)因子（IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等）在炎癥的消退、組織重塑過程中發(fā)揮關鍵作用［1-3］。而糖皮質(zhì)激素在慢性阻塞性肺疾病等炎癥性疾病和風濕性疾病治療中有著無法代替的地位［4］，恰恰這部分患者往往具有冠心病危險因素的存在，極易誘發(fā)急性心肌梗死。有研究表明，糖皮質(zhì)激素能夠抑制巨噬細胞介導的免疫炎癥反應，調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2 型極化，并使其促炎性細胞因子分泌減少，在炎癥消退中發(fā)揮重要作用［5-8］。特別是對于需要臨床常規(guī)應用激素治療但又罹患AMI 的患者來說，糖皮質(zhì)激素的應用是非常必要的，但是糖皮質(zhì)激素對于AMI 的影響卻鮮有報道。本研究通過大鼠建立AMI 模型，探討地塞米松對AMI 的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器Vivid E9 彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE 公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應儀（美國AppliedBiosystems 公司），Trizol（美國Invitrogen 公司），One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒（日本TaKaRa 公司）。

1.1.2 實驗動物及分組44只雄性SD大鼠（動物合格證號：SCXK 魯20190003），體質(zhì)量220～250 g，采用隨機等間隔抽樣法抽取8 只為假手術組，其他36 只大鼠采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立AMI 模型，將術后24 h 建模成功存活的19 只大鼠隨機分為對照組10 只和實驗組9 只。實驗組大鼠于模型建立后24 h 給予地塞米松1 mg/kg 肌肉注射1 次，假手術組及對照組大鼠于術后24 h 給予0.2 mL/kg 等容生理鹽水肌肉注射。該研究得到了濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗動物倫理委員會的批準。

1.1.3 大鼠AMI 模型的建立實驗大鼠的麻醉采用腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），將成功麻醉后的SD 大鼠取其仰臥位固定到操作臺上，經(jīng)口腔進行氣管插管，成功后連接到小動物呼吸機上，呼吸機設定：呼吸頻率設置為60 次/min，潮氣量設置為3 mL/l00 g，呼吸時比設置為3∶2。選取大鼠3、4 肋間胸骨左緣0.5 cm 處為手術切口，予以剪毛備皮后碘伏消毒，切開皮膚后鈍性分離，暴露出大鼠的心臟，打開心包后在左心耳的下緣用6/0 帶線眼科針縫扎左冠狀動脈前降支，可見室壁搏動減弱蒼白，心電圖ST 段或T 波抬高表示成功。然后，縫合大鼠胸廓肌肉、皮下組織和皮膚，關閉大鼠胸腔，隨后3 d，每12 h 肌肉注射400 000 U 青霉素。待大鼠的自主呼吸恢復后撤掉呼吸機。假手術組的8 只大鼠只進行開胸、左冠狀動脈前降支血管下穿線，但不予血管結(jié)扎，其他的手術步驟相同。

1.2 方法

1.2.1 超聲心動圖檢查術后4 周各組大鼠行超聲心動圖檢查，檢測各組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）。

1.2.2 大鼠心肌組織取材及標本制備建模4 周后，各組大鼠用10%水合氯醛300 mg/kg 腹腔注射，麻醉、處死，快速開胸取出心臟，冰鹽水沖洗后，沿結(jié)扎處垂直于心臟長軸方向?qū)⒆笮氖乙环譃槎?，部分心肌貯存于液氮中待用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）的檢測，其余部分心肌組織于70%乙醇過夜，隨后經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切成厚度4 μm 的切片，再經(jīng)過60 ℃烤片后室溫放置過夜，待自然干燥后行蘇木精-伊紅（HE）染色，應用光學顯微鏡觀察切片病理變化。

1.2.3 RT-PCR 檢測巨噬細胞標志物的mRNA 表達水平使用Trizol 法提取梗死區(qū)周圍心肌細胞總RNA，將1 μg 的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，RT-PCR 檢測M1 型巨噬細胞標志物TNF-α、IL-6 及M2 型巨噬細胞標志物IL-10、TGF-β1 的mRNA 水平。見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0 軟件對本研究所涉及數(shù)據(jù)進行相關處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多重比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用例（%）表示，應用χ2檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況比較假手術組大鼠因麻醉過深死亡1只，存活率為87.5%；36只AMI模型組大鼠，術后24 h 內(nèi)存活19 只，存活率為55.9%，明顯低于假手術組（P＜0.05）；對照組及實驗組大鼠1 周內(nèi)各死亡2 只，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；其余大鼠存活至實驗結(jié)束。

2.2 超聲心動圖結(jié)果術后4 周，3 組大鼠LVESD、LVEDD、LVEF、FS 比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），與假手術組比較，對照組及實驗組大鼠LVESD、LVEDD 均升高，LVEF、FS 均降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠LVESD、LVEDD 均降低，LVEF、FS 均升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 術后4 周各組大鼠超聲心動圖指標比較Tab.2 Comparison of echocardiographic indexes of rats in each group 4 weeks after operation ±s

表2 術后4 周各組大鼠超聲心動圖指標比較Tab.2 Comparison of echocardiographic indexes of rats in each group 4 weeks after operation ±s

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.05。t1，對照組與假手術組比較；t2，實驗組與假手術組比較；t3，實驗組與對照組比較

組別假手術組對照組實驗組t1值t2值t3值F值例數(shù)7 8 7 LVESD（mm）3.75±0.35 7.12±0.58*6.04±0.47*#-13.316-10.326 3.894 93.033 LVEDD（mm）7.48±0.49 9.97±0.86*8.55±0.63*#-6.708-3.558 3.584 24.631 LVEF（%）69.27±6.23 32.60±3.56*39.97±4.71*#14.239 9.924-3.448 114.299 FS（%）50.45±3.22 24.07±3.03*29.77±3.51*#16.340 11.486-3.374 132.926

2.3 左心室組織形態(tài)學改變術后4 周HE 染色顯示：假手術組的心肌細胞纖長，大小均勻，排列有序，無明顯炎性細胞的浸潤；對照組的心肌細胞腫大明顯，排列雜亂無章，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂，可見明顯炎性細胞的浸潤；實驗組心肌細胞稍有腫大，排列稍雜亂，心肌纖維偶有斷裂，稍有炎性細胞浸潤（圖1）。

圖1 心肌組織HE 染色結(jié)果（HE，×200）Fig.1 HE staining results of myocardial tissue（HE，×200）

2.4 術后4周梗死區(qū)周圍組織M1型巨噬細胞標志物IL-6、TNF-α和M2 型巨噬細胞標志物IL-10、

TGF-β1的mRNA表達水平術后4周，3組大鼠梗死區(qū)周圍組織IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β1的mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。與假手術組比較，對照組與實驗組大鼠IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1 的mRNA 表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠IL-6、TNF-α mRNA 相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），IL-10、TGFβ1 的mRNA 表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1 的mRNA 相對表達量統(tǒng)計Tab.3 Statistics of relative expression of IL-6，TNF-α，IL-10 and TGF-β1 mRNA in each group ±s

表3 各組IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1 的mRNA 相對表達量統(tǒng)計Tab.3 Statistics of relative expression of IL-6，TNF-α，IL-10 and TGF-β1 mRNA in each group ±s

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.05。t1，對照組與假手術組比較；t2，實驗組與假手術組比較；t3，實驗組與對照組比較

組別假手術組對照組實驗組t1值t2值t3值F 值例數(shù)7 8 7 IL-6 mRNA 0.50±0.13 1.65±0.13*0.99±0.10*#-16.966-7.555 10.837 164.551 TNF-α mRNA 0.57±0.13 2.37±0.20*1.00±0.11*#-20.037-6.545 15.984 274.265 IL-10 mRNA 0.42±0.16 1.05±0.13*1.80±0.12*#-8.291-18.329-11.481 175.571 TGF-β1 mRNA 0.44±0.11 0.93±0.17*1.43±0.15*#-6.430-13.978-5.899 77.546

3 討論

近年來，AMI 的發(fā)病率居高不下［9］，心梗后心衰也就成了心血管系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，也是致死的主要原因。眾所周知，AMI 后的心室重構(gòu)是其重要病理基礎。AMI 出現(xiàn)后，即有大量的中性粒細胞滲入到梗死部位，隨后出現(xiàn)單核巨噬細胞的浸潤，在AMI 后的炎癥反應及損傷壞死組織的修復中發(fā)揮著重要作用［10］，并影響患者的心室重構(gòu)及心功能。過度的炎癥反應會加重組織損傷，延緩組織修復，在梗死心肌組織修復過程中單核巨噬細胞介導的炎癥顯得尤為重要［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地塞米松干預后，實驗組大鼠的促炎細胞因子TNF-α、IL-6 的表達明顯低于對照組，而抑炎細胞因子IL-10、TGF-β1 的表達明顯高于對照組，實驗組大鼠的心肌組織形態(tài)學改變及心功能也顯著優(yōu)于對照組，提示糖皮質(zhì)激素可調(diào)節(jié)心肌梗死后心肌組織的炎癥因子的表達，小劑量地塞米松可減輕心肌梗死后的炎癥反應，減輕心肌損傷，改善心肌梗死后心功能。

巨噬細胞在機體的宿主防御、炎癥反應等調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要作用，是先天免疫的重要組成部分，巨噬細胞極化不是固定的，因為巨噬細胞具有足夠的可塑性，可以整合多種信號，例如來自微生物、受損組織和正常組織環(huán)境的信號［1-3，12-13］。在激活過程中巨噬細胞主要有促炎的M1 型和抗炎的M2 型巨噬細胞兩種亞型，M1 型巨噬細胞可以誘導表達TNF-α及IL-6 等細胞因子，M2 型巨噬細胞具有高表達IL-10 的表型特征，可以誘導表達TGF-β等細胞因子［1，12，14-15］。研究［16-17］表明，單核巨噬細胞細胞介導的炎癥是心肌缺血再灌注損傷和AMI后愈合過程的主要機制。MASAKI等［18］研究發(fā)現(xiàn)，用過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激動劑靶向干預動物模型中的單核細胞/巨噬細胞極化，使其偏移于抗炎的M2 型，可抑制急性炎癥并促進AMI 后心臟愈合，降低了AMI 后的病死率。

目前，在人體及動物實驗研究均發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素是M2 型巨噬細胞極化的重要刺激物［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)：術后4 周，對照組及實驗組大鼠心肌梗死區(qū)周圍組織的M1 型巨噬細胞標志物IL-6、TNF-α和M2 型巨噬細胞標志物IL-10、TGF-β1 的mRNA 表達水平均高于假手術組，但在實驗組大鼠的M1 型巨噬細胞標志物IL-6、TNF-α明顯低于對照組，而M2 型巨噬細胞標志物IL-10、TGF-β1 的mRNA 表達水平明顯高于對照組，提示心肌梗死后存在明顯巨噬細胞的浸潤，而糖皮質(zhì)激素的干預可能促進心肌梗死區(qū)浸潤的巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化，從而減輕心肌梗死后的炎癥反應，減輕心肌損傷，保護心功能。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能夠通過調(diào)節(jié)M1 型巨噬細胞向M2 型極化來抑制心肌組織炎癥反應及梗死后心室重構(gòu)，特別是對于具有糖皮質(zhì)激素適應征的其他基礎疾病的AMI 患者，本研究提供了一定的臨床意義，但其具體加用糖皮質(zhì)激素的時間、劑量以及糖皮質(zhì)激素的多效性和巨噬細胞的多面性在AMI 的轉(zhuǎn)歸和預后中還存在眾多未知領域，還需要進一步的研究。