沉默鈣敏感受體對大鼠尿鈣排泄影響及對緊密連接蛋白14的作用

崔慶鵬 劉孝東 范世成 朱元全 羅云 羅鈺輝

1云南省第三人民醫(yī)院泌尿外科（昆明650000）；2昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明650032）

泌尿系結(jié)石又稱為尿石癥，是一種古老的疾病。在不同的國家，不同的地區(qū)發(fā)病率不一，在歐美國家，其發(fā)病率為2%～19%［1］；在我則為為1%～5%，而我國云南及其他西南地區(qū)發(fā)病率更高達5%～10%［2］。泌尿系結(jié)石的病因復雜，多種因素與泌尿系結(jié)石的形成相關(guān)，代謝異常被認為是最重要的因素之一［2］。目前普遍認為代謝異常是泌尿系原發(fā)結(jié)石最主要的病因。而在含鈣泌尿系結(jié)石患者中，特發(fā)性高鈣尿癥是最常見的［3］。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaR/CaSR）被認為在特發(fā)性高鈣尿癥的形成中扮演了重要角色。表達于腎臟的緊密連接蛋白14（the tight junction protein claudin-14，CLDN14），在尿Ca2+的排泄中具有重要意義，而CLDN14 受到CaSR 的調(diào)節(jié)，激活的CaSR 上調(diào)CLDN14 的表達，導致尿鈣增加，形成含鈣泌尿系結(jié)石［4］。但目前關(guān)于CaSR 在特發(fā)性高鈣尿癥中的作用機制并不完全清楚。我們通過建立遺傳高鈣尿結(jié)石形成大鼠（genetic hypercalciuric stones forming rats，GHS）模型，對大鼠進行CaSRmiRNA 慢病毒干擾，通過檢測CLDN14 的mRNA 和蛋白表達水平以及24 h 尿鈣的排泄量，來研究CaSR 與特發(fā)性高鈣尿癥的關(guān)系，為泌尿系結(jié)石的藥物預防及治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料雄性并且性成熟的健康SD大鼠；shRNA載體；Lipofectamine2000、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、T4DNA 連接酶、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購、限制性內(nèi)切酶XholⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NRK-52E 細胞、兔抗大鼠CaSR 多克隆抗體、慢病毒、質(zhì)粒DNA 小量試劑盒、RNA 提取試劑、RNase-free DNaseⅠ試劑盒、RIPA 細胞總蛋白提取液、大腸桿菌菌株DH5α、Trizol PCR 試劑盒、ECL 試劑盒、第1鏈cDNA 合成試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 GHS 大鼠模型的建立通過選擇尿鈣最高的近親雌雄大鼠反復傳代［5］，培育出了GHS 大鼠模型。一般認為大鼠尿鈣值＞1.5 mg/24 h，高于對照組大鼠尿鈣排泄平均值兩個標準差為大鼠高尿鈣的標準。

1.2.2 CaSR-miRNA 慢病毒載體的制備本實驗組前期已完成，參見參考文獻［6］。

1.2.3 動物分組及體及病毒體內(nèi)干擾實驗雄性GHS大鼠和雄性正常尿鈣對照組大鼠（Normal control rats，NC）各20只，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡2～3 個月，隨機分為5 組，每組4 只，第1～4 組采用干擾病毒進行體內(nèi)干擾作為實驗組，第5 組采用等量0.9%氯化鈉溶液干預作為對照組。慢病毒載體通過外科手術(shù)從大鼠腎靜脈注入腎臟內(nèi)。在注射病毒后3、7、14、21 d 分別處死實驗組大鼠，取雙腎；留作PCR 及WB 標本。于病毒干擾后21 d 時處死對照組大鼠并留取標本。應用全自動生化分析儀在處死大鼠前測定各組大鼠的2 個24 h 尿鈣排泄?jié)舛?，并計?4 h 的尿鈣排泄量。

1.2.4 全自動生化分析儀檢測尿鈣濃度

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應各組腎臟組織樣本按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，反應液的配制：2×Premix SYBR Green Ⅰ10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL，10 μmol/μL 的上、下游引物各0.4 μL，共40 個循環(huán)（以上操作在冰上進行）。結(jié)果以GAPDH 的Ct 值作內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法進行樣本分析。PCR 引物如下所示（表1）。

表1 PCR 引物表格Tab.1 PCR primer table

1.2.6 Western 印跡提取細胞總蛋白，進行SDSPAGE 電泳，后行PVDF 轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。在室溫下用TBST 溶液洗脫適量一抗三次，每次10 min。室溫孵育按1∶3 000 稀釋的二抗30 min，并用TBST 洗脫三次，每次10 min。最后進行化學發(fā)光檢測，目標帶的光密度值采用imageJ 軟件進行。

1.3 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism6.0進行。多組計量資料采用完全隨機設(shè)計的方差分析進行，兩組間計量資料采用t檢驗進行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GHS大鼠模型的成功建立通過選擇尿鈣最高的近親雌雄大鼠反復傳代的方法在第六代時成功建立了CHS大鼠模型。第6代GHS大鼠組中88.2%（15/17）的雄性大鼠和94.1%（16/17）的雌性大鼠尿鈣高于1.5 mg/24 h。其24 h尿鈣排泄量見表2。

表2 各組大鼠的尿鈣排泄量Tab.2 Urinary calcium excretion of rats in each group ±s

表2 各組大鼠的尿鈣排泄量Tab.2 Urinary calcium excretion of rats in each group ±s

注：F 組間=77.245，P 組間＜0.001；PGHS1 與NC1＜0.001；PGHS1 與NC2＜0.001；PGHS1與GHS2=0.789；PNC1與GHS2＜0.001；PNC1與NC2=0.799；PGHS2與NC2＜0.001

組別GSH 雄性組NC 雄性組GSH 雌性組NC 雌性組例數(shù)15 15 16 16尿鈣值（mg/24 h）2.784±0.594 1.074±0.162 2.742±0.590 1.114±0.138

2.2 腎臟組織CaSR-miRNA 慢病毒干擾后對大鼠尿鈣排泄的影響慢病毒干擾后，與對照組相比：GHS 實驗組大鼠尿鈣排泄量下降（圖1）；NC 實驗組大鼠尿鈣排泄量稍有減少，但對比NC 對照組大鼠無明顯變化（圖2）。

圖1 GHS 實驗組大鼠尿鈣比較圖Fig.1 Comparison of urinary calcium in rats in GHS group

圖2 NC 實驗組大鼠尿鈣比較圖Fig.2 Comparison of urinary calcium in the NC experimental group

2.3 Real-timePCR 檢測GHS 組和NC 組大鼠CLDN14 不同時段mRNA 表達水平慢病毒干擾后，CHS 組CLDN14 mRNA 表達水平下降，較對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組相比，NC 組CLDN14 mRNA 表達水平較變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 干擾后GHS 組與NC 組大鼠CLDN14 基因的mRNA表達水平圖Fig.3 mRNA expression levels of CLDN14 gene in GHS group and NC group after interference

2.4 Western blot檢測CLDN14的蛋白表達GHS組與NC組上CLDN14 蛋白質(zhì)表達圖（以β-actin 為內(nèi)參，以各條帶control 組為校準）見圖4、5。其灰度值統(tǒng)計圖見圖6。

圖4 GHS 組大鼠鈣CLDN14 的蛋白表達檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of calcium CLDN14 protein expression in rats in GHS group

圖5 NC 組大鼠鈣CLDN14 的蛋白表達檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of calcium CLDN14 protein expression in NC group

圖6 干擾后GHS 組與NC 組大鼠CLDN14 蛋白的表達水平變化圖Fig.6 Changes in the expression levels of CLDN14 protein in GHS group and NC group after interference

3 討論

GHS 大鼠動物模型是由BUSHINSKY 等學者于20世紀首先培育出的，該動物模型自被培育出以后就引起了人們足夠的重視。筆者按照前人的方法，成功建立了GHS大鼠模型。通常認為大鼠尿鈣值＞1.5 mg/24 h，高于對照組大鼠尿鈣排泄平均值兩個標準差為大鼠高尿鈣的標準。在第六代模型鼠中，17只雄性大鼠中15只達到高尿鈣標準，其24 h 尿鈣分別為（2.78±0.59）mg/24 h；17 只雌性大鼠中16 只達到高尿鈣標準，（2.74±0.59）mg/24 h。而正常尿鈣對照組大鼠雄性及雌性大鼠的24 h尿鈣排泄量分別為（1.07±0.16）mg/24 h 和（1.11±0.14）mg/24 h，因此本研究成功的建立了GHS 大鼠動物模型。

1933年BROWN等［7］第一次在牛甲狀旁腺細胞中發(fā)現(xiàn)了CaSR，人們就對這對其產(chǎn)生了足夠的興趣，進行了一系列的研究。LIU 等［8］研究表明CaSR基因位于人類3號染色體上，由7個外顯子，兩個啟動子組成，共1 078 個氨基酸殘基，是G 蛋白偶聯(lián)受體家族的一員。維生素D3 可通過調(diào)控其兩個啟動子來促進其表達。CaSR 的拓撲結(jié)構(gòu)由TENNAKOON 等［9］闡明，一是胞膜外親水性的胞外區(qū)氨基結(jié)構(gòu)域（extracellular N terminal domain，ECD），作用是與相關(guān)配體結(jié)合；二是胞膜上跨膜區(qū)域（transmembrane domain，TMD）是G蛋白偶聯(lián)受體家族的特征性結(jié)構(gòu)，是細胞間的信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵位置；最后是胞內(nèi)羧基結(jié)構(gòu)域（intercellular domain，ICD），是蛋白激酶磷酸化的區(qū)域。3 個區(qū)域構(gòu)成典型的G 蛋白偶聯(lián)受體通道，在細胞間的信號轉(zhuǎn)導方面起到了重要作用。母目前的研究發(fā)現(xiàn)CaSR 不僅表達于甲狀旁腺，還廣泛表達于腎臟、骨、胃腸道等組織，可感染細胞外的Ca2+變化，在體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)方面起到了十分重要的作用［10-11］。

筆者通過對GHS組大鼠及NC組大鼠進行CaSRmiRNA 慢病毒體內(nèi)干擾實驗后發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，GHS 組大鼠的尿鈣排泄量在干擾后的第3～21天下降明顯，而在NC 組大鼠中卻未發(fā)現(xiàn)尿鈣排泄量有下降。這一現(xiàn)象說明了GHS 大鼠可能高表達CaSR，而過高表達的CaSR 可能引起大鼠發(fā)生高鈣尿癥。王少剛［12］、李朋［13］等的研究團隊也成功培育GHS 大鼠模型，他們的研究均表明CaSR 在GHS鼠腎臟高表達，在NC 組大鼠腎臟低表達。因此NC 組大鼠慢病毒干擾后尿鈣排泄值變化不大，這是由于NC 組大鼠低表達CaSR，CaSR-miRNA 慢病毒體內(nèi)干擾后沒有產(chǎn)生足夠的CaSR 基因沉默，不足以引起NC 組大鼠24 h 尿鈣排泄值產(chǎn)生變化。

目前，研究［12-13］還表明GHS大鼠腎臟組織CaSR的表達過高可能與大鼠的高鈣尿癥相關(guān)。本實驗進一步表明，CaSR 可能通過調(diào)節(jié)腎小管CLDN14的表達來調(diào)節(jié)腎臟對尿鈣的重吸收。

CLDN14 廣泛表達于髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）中，對尿鈣在TAL 中的重吸收起到了十分重要的作用［14］。CLDN14 是一種膜蛋白，在上皮細胞緊密連接處細胞旁離子和小的溶質(zhì)的通透性方面有重要作用［15］。DIMKE 等［16］研究發(fā)現(xiàn)：在通常情況下，腎臟組織中CLDN14 基因是低表達的。此時細胞旁離子和小溶質(zhì)有較強的通過性。而當CaSR 被激活后，腎臟CLDN14 基因表達增強，降低了此種通過性。他的實驗還說明高Ca2+飲食會增加腎臟CLDN14 表達，低Ca2+或正常飲食時，腎臟CLDN14 表達不變，這表明Ca2+可能是CLDN14 表達的激活物。使用西那卡塞（一種擬鈣劑），可以增加CaSR對Ca2+的敏感性，促使CLDN14表達量提高了40 倍。過度表達的CLDN14 會增加細胞間抵抗性，使細胞間的連接更加密集，降低了細胞旁Ca2+的通過量。以上研究結(jié)果說明了過多的游離Ca2+通過激活CaSR 正向調(diào)節(jié)CLDN14 的表達，進而導致尿液中Ca2+的重吸收減少，導致了原發(fā)性泌尿系結(jié)石的產(chǎn)生。CaSR 對CLDN14 的調(diào)控過程可能是通過CLDN14表達miRNAs而受到CaSR的調(diào)控［17-18］。在小鼠中，激活的CaSR通過活化T細胞 的 核 因 子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）介導的抑制微小RNA（miR9 和miR374）的組蛋白脫乙?；磉_機制來調(diào)控CLDN14 的轉(zhuǎn)錄［17-20］。本研究表明與對照組相比，病毒體內(nèi)干擾后，GHS 組大鼠CLDN14mRNA 和蛋白表達量減少，NC 組大鼠CLDN14mRNA 和蛋白表達量則無明顯變化。說明在GHS 大鼠組中高表達的CaSR 正向調(diào)控了CLDN14 基因的表達，這一調(diào)控機制在NC組中則不明顯。

綜上所述，CaSR 對尿鈣重吸收的影響可能是通過對鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白CLDN14 的調(diào)控來實現(xiàn)的。CaSR 的過度激活可能導致高鈣尿癥的發(fā)生，尿中過多的Ca2+沉積導致了原發(fā)性含鈣尿結(jié)石的產(chǎn)生。CaSR 可能成為泌尿系結(jié)石預防與治療的一個藥物靶點。但本實驗未敲除CLDN14 基因，尚不能完全證明上述結(jié)論，在接下來的研究中，筆者將敲除CLDN14 基因，控制特異性。同時，我們將增強CaSR 的表達，探究在CaSR 激活后，大鼠腎臟CLDN14 mRNA 及蛋白表達情況及尿鈣排泄情況，來進一步研究CaSR 在高鈣尿癥及泌尿系結(jié)石中的作用機制。