苯噻草胺除草劑暴露對(duì)中華鱉胚胎發(fā)育及孵出幼體表型的影響

黃心怡，周 瑞，胡佳穎，金 典，張辰歡，陸洪良

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

苯噻草胺(英文名mefenacet，分子式C16H14N2O2S)是20世紀(jì)80年代研發(fā)的一種酰胺類除草劑，主要通過(guò)抑制禾本科雜草細(xì)胞生成和分裂而達(dá)到除草的效果[1].因其低毒、高效除草作用，苯噻草胺在我國(guó)水稻田間得到了廣泛的應(yīng)用.在生產(chǎn)實(shí)踐中，田間苯噻草胺施用后大部分在數(shù)天內(nèi)得到降解(稻田水體半衰期1.6～2.1 d，土壤半衰期3.7～12.3 d[2]).然而，部分殘留物及其降解產(chǎn)物仍可能長(zhǎng)時(shí)間存留于水體或稻田土壤中，從而對(duì)生活于水體及土壤中的生物造成毒害作用[3-4].目前，僅有少數(shù)研究報(bào)道了苯噻草胺對(duì)包括浮游植物、兩棲類幼體在內(nèi)的水生生物毒理效應(yīng)[4-6].例如，苯噻草胺的施用對(duì)稻田熱帶爪蟾(Siluranatropicalis)蝌蚪顯示出微弱的毒害作用[5].

龜鱉類動(dòng)物大部分時(shí)間生活于水體中，水中的農(nóng)藥殘留物可能會(huì)在其體內(nèi)不斷累積而造成長(zhǎng)期傷害.中華鱉(Pelodiscussinensis)是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在南方各省區(qū)被廣泛養(yǎng)殖.這些地區(qū)，中華鱉常養(yǎng)殖于緊鄰稻田的人工池塘，稻田中施用的農(nóng)藥殘留物很可能隨水流進(jìn)入養(yǎng)殖塘.此外，中華鱉卵常被產(chǎn)于水塘邊堤岸的土壤中，發(fā)育中的胚胎潛在地會(huì)受到土壤中殘余農(nóng)藥的毒害作用.檢測(cè)稻田常用農(nóng)藥對(duì)中華鱉個(gè)體以及胚胎發(fā)育的作用，既可增加基礎(chǔ)性的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，也有助于商品中華鱉的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.本文用不同濃度的苯噻草胺處理孵化過(guò)程中的中華鱉受精卵以檢測(cè)該除草劑對(duì)其胚胎發(fā)育、孵出幼體形態(tài)、運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)及肝臟生理的影響.

1 材料與方法

1.1 中華鱉受精卵收集

從余杭龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)新生的中華鱉受精卵150枚，帶回實(shí)驗(yàn)室，測(cè)量每一卵的大小(直徑和質(zhì)量)并編號(hào)，隨機(jī)分為5個(gè)不同苯噻草胺質(zhì)量濃度處理組(蒸餾水組、助溶劑組(二甲基亞砜)、0.6、6.0、60.0 mg/L)，每組30枚.所有受精卵分配到含有-220 kPa濕度基質(zhì)(m蛭石∶m水=1∶1)的孵化盒中，利用點(diǎn)光源確定胚胎位置，受精卵放入基質(zhì)時(shí)將胚胎位置向上，并在每個(gè)胚胎上放置大小相等的紗布小圓片(打孔器打出)，孵化盒放置在預(yù)先設(shè)定為30 ℃的恒溫孵化箱中孵化.每隔1 d檢查是否有發(fā)霉的鱉卵，補(bǔ)充因蒸發(fā)失去的水分，并調(diào)節(jié)孵化盒在孵化箱內(nèi)的相對(duì)位置，以排除孵化箱內(nèi)部溫差所造成的潛在影響.

1.2 中華鱉受精卵孵化處理

根據(jù)處理組濃度，每隔1 d用移液槍吸取100 μL的相應(yīng)苯噻草胺溶液滴加在胚胎位置的中華鱉受精卵表面紗布上.在孵化過(guò)程中每隔3 d檢查鱉卵的發(fā)霉情況，及時(shí)補(bǔ)充基質(zhì)水分和移除霉變的卵.

1.3 幼體大小與運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)

幼體孵出后，記錄孵出時(shí)間以計(jì)算孵化期，檢查其形態(tài)畸形情況，用電子天平測(cè)量幼體質(zhì)量，待腹部卵黃完全吸收后，在29 ℃體溫條件下測(cè)定幼體運(yùn)動(dòng)(游泳)表現(xiàn).測(cè)定游泳表現(xiàn)時(shí)，將動(dòng)物放在120 cm×10 cm×20 cm的玻璃泳道，用毛刷驅(qū)趕動(dòng)物向前游動(dòng)，同時(shí)用SONY DCR-SR220E數(shù)碼攝像機(jī)拍攝動(dòng)物在泳道中的游泳過(guò)程，隨后分析行為錄像.截取其中動(dòng)物持續(xù)向前游動(dòng)的3個(gè)不同視頻片段，計(jì)算每一片段中動(dòng)物游過(guò)25 cm距離的速度(cm/s)，取平均值用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析.

1.4 幼體生長(zhǎng)發(fā)育情況

孵化出的中華鱉幼體單獨(dú)飼養(yǎng)于直徑為20 cm的盒內(nèi)，盒內(nèi)含水高度約3 cm，定期喂食，每隔一個(gè)月用電子天平測(cè)量其質(zhì)量，并與原來(lái)質(zhì)量進(jìn)行比較分析.

1.5 幼體肝臟生理指標(biāo)

購(gòu)買(mǎi)魚(yú)甘油三酯(triglyceride, TG)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)ELISA檢測(cè)試劑盒.隨機(jī)選取剛孵出幼鱉每組10只，放置在碎冰上麻醉后解剖，取肝臟，并稱重.將肝臟按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9比例加入0.85%生理鹽水，冰水浴上機(jī)械研磨成勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)定肝臟TG含量和SOD活力.將得到的中華鱉幼體肝臟濕質(zhì)量除以其自身體質(zhì)量來(lái)表示其肝臟指數(shù).

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析前，分別檢驗(yàn)其正態(tài)性(Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn))和方差同質(zhì)性(Bartlett檢驗(yàn)).用單因子方差分析檢測(cè)苯噻草胺處理對(duì)中華鱉受精卵大小、孵化期、孵出幼體游泳速度、肝臟生理指標(biāo)的影響；以卵質(zhì)量為協(xié)變量的單因子協(xié)方差分析檢測(cè)苯噻草胺處理對(duì)孵出幼體大小(體質(zhì)量)的影響；用重復(fù)測(cè)量方差分析檢測(cè)孵出幼體早期生長(zhǎng)情況；用卡方(χ2)檢驗(yàn)檢測(cè)不同濃度苯噻草胺處理組卵孵化成功率的差異.描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平設(shè)置為α =0.05.

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苯噻草胺對(duì)中華鱉胚胎發(fā)育的影響

入孵的中華鱉卵皆是受精卵，孵化過(guò)程中可見(jiàn)其受精白斑在不斷擴(kuò)大，直至整顆卵呈白色.不同處理組的初始卵質(zhì)量無(wú)顯著組間差異(F4, 148=1.17,P=0.326).苯噻草胺處理對(duì)孵化成功率(χ2=0.40,df=4,P=0.983)無(wú)顯著影響，但苯噻草胺處理下的卵孵化時(shí)間有所縮短(F4,128=6.20,P<0.01)(表1).

表1 不同濃度苯噻草胺處理下中華鱉入孵卵大小、孵化率及孵化時(shí)間Tab.1 Egg size, hatching success and incubation period of Pelodiscus sinensis under different concentration treatments of mefenacet

2.2 不同濃度苯噻草胺對(duì)中華鱉孵出幼體大小和游泳速度的影響

苯噻草胺處理對(duì)孵出幼體大小(以卵質(zhì)量為協(xié)變量的協(xié)方差分析：F4,126=1.06,P=0.377)和肝臟大小(以幼體質(zhì)量為協(xié)變量的協(xié)方差分析：F4,39=1.80,P=0.149)無(wú)顯著影響.苯噻草胺處理對(duì)孵出幼體游泳速度無(wú)顯著影響(F4,80=1.76,P=0.146)(圖1).

圖1 不同苯噻草胺處理組孵出中華鱉幼體游泳速度Fig.1 Swimming performance of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

2.3 不同濃度苯噻草胺對(duì)中華鱉幼體生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響

孵出幼體在前3個(gè)月內(nèi)體質(zhì)量增加明顯(F3,240=2333.05,P<0.001)，但是苯噻草胺處理對(duì)幼體早期生長(zhǎng)的影響不顯著(F4,80=0.89,P=0.477)(圖2).

圖2 不同苯噻草胺處理組中華鱉幼體的生長(zhǎng)狀況Fig.2 Growth status of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

2.4 不同濃度苯噻草胺對(duì)中華鱉幼體肝臟甘油三酯含量和超氧化物歧化酶活性的影響

苯噻草胺處理對(duì)孵出幼體肝臟指數(shù)無(wú)顯著影響(F4,40=1.54,P=0.208)(圖3).苯噻草胺處理對(duì)孵出幼體肝臟TG含量(F4,45=0.34,P=0.849)和SOD活性(F4,45=1.73,P=0.160)無(wú)顯著影響(圖4).

圖3 不同苯噻草胺處理組中華鱉幼體的肝臟指數(shù)Fig.3 Liver index of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of mefenacet

3 討論

爬行動(dòng)物胚胎發(fā)育期是生命周期中最為脆弱的時(shí)期.胚胎期直接暴露于一定濃度的農(nóng)藥下可能造成胚胎死亡或者孵出幼體畸形影響后續(xù)生存表現(xiàn).本研究測(cè)定的中華鱉所有變量(包括胚胎存活、孵出幼體表型及肝臟生理指標(biāo))在不同苯噻草胺濃度處理組間均無(wú)顯著差異，表明在一定濃度條件下苯噻草胺暴露對(duì)中華鱉胚胎發(fā)育及幼體的影響是有限的.胚胎期除草劑暴露對(duì)其他龜鱉類動(dòng)物無(wú)明顯的毒害效應(yīng)也見(jiàn)于其他研究，例如一定濃度的異丙甲草胺、草甘膦暴露對(duì)北美擬鱷龜(Chelydraserpentina)、紅耳滑龜(Trachemysscriptaelegans)和中華鱉胚胎及孵出幼體表現(xiàn)的影響并不大[7-9].當(dāng)然在高濃度除草劑處理下也檢測(cè)到卵孵化成功率會(huì)有所降低[7].相反，殺蟲(chóng)劑(如毒殺芬、溴氰菊酯)暴露常會(huì)直接引起龜鱉類動(dòng)物胚胎死亡[10-11].因此，與其他有機(jī)磷除草劑或殺蟲(chóng)劑農(nóng)藥相比，苯噻草胺對(duì)水生生物的毒害作用應(yīng)是較低的.

已有研究也顯示，不同濃度的苯噻草胺處理對(duì)熱帶爪蟾(S.tropicalis)蝌蚪的毒害效應(yīng)不明顯[4].在質(zhì)量濃度為0.03和0.3 mg/L的苯噻草胺處理下，并沒(méi)有觀察到虛弱或者死亡的爪蟾蝌蚪，所檢測(cè)的蝌蚪形態(tài)(脊柱側(cè)位畸形)及行為變量(不協(xié)調(diào)游泳、過(guò)度通氣、不典型靜止等)與助溶劑對(duì)照處理個(gè)體亦無(wú)顯著的差異[4].而在一項(xiàng)研究中顯示，苯噻草胺處理對(duì)熱帶爪蟾24 h的中致死質(zhì)量濃度為2.7～3.0 mg/L[5].此外，在不同藻類測(cè)試中，苯噻草胺的72 h半效應(yīng)質(zhì)量濃度為0.25～0.67 mg/L[6].雖然苯噻草胺對(duì)水生動(dòng)物的毒性較低，但是其所造成的潛在毒害仍然存在.在一定濃度范圍內(nèi)，苯噻草胺處理是否影響水生動(dòng)物遺傳物質(zhì)損傷、某些基因表達(dá)等毒理效應(yīng)仍有待于后續(xù)研究.

本研究中華鱉孵出幼體肝臟生理指標(biāo)(肝臟指數(shù)、TG含量和SOD活性)不隨著苯噻草胺濃度的增加而改變，這與其他有機(jī)磷除草劑暴露的研究結(jié)果存在差異.例如，一些有機(jī)磷除草劑暴露可能導(dǎo)致受試動(dòng)物肝臟脂肪積累而顯示出致肥胖效應(yīng)[12]，SOD活性上升[13-14].苯噻草胺污染引起的SOD活性變化僅見(jiàn)于一些細(xì)菌研究，顯示出隨苯噻草胺濃度增加，SOD活性先上升后下降的趨勢(shì)[15-16].對(duì)于苯噻草胺暴露是否會(huì)引起水生動(dòng)物肝臟生理及抗氧化防御反應(yīng)變化的問(wèn)題，仍需要在更多物種中進(jìn)行相關(guān)測(cè)試才可能得以解答.