數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在雌激素對心血管的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的應(yīng)用

李艷紅，楊亞莉，陳芬，萬翔，龔芳

作者單位：1長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院，a心電圖室，b心內(nèi)科，湖北 仙桃433000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢430022；3襄陽市中心醫(yī)院，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 襄陽441021

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）是世界范圍內(nèi)常見的高病死率疾病，嚴(yán)重威脅人們的生命健康［1］。與男性相比，女性病人的發(fā)病年齡雖然較晚，但病死率及并發(fā)癥的發(fā)生率均高于男性［2］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前女性心血管疾病發(fā)病率較低，絕經(jīng)后明顯增高，這是由于女性體內(nèi)的雌激素可以影響血脂代謝，對心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用［3-4］。此外，有研究指出在時(shí)間窗口期應(yīng)用雌激素對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。但是，也有研究［5-6］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用口服雌孕激素替代治療對心血管并沒有保護(hù)作用。因此，關(guān)于雌激素對心血管系統(tǒng)的作用引起廣泛的關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究2019年1—3月通過篩選雌激素作用后的差異基因，進(jìn)一步明確雌激素在心血管系統(tǒng)中的調(diào)控靶點(diǎn)及作用網(wǎng)絡(luò)，從而為進(jìn)一步明確雌激素在心血管系統(tǒng)中的作用提供方向。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)檢索通過NCBIGEODatasets檢索雌激素在心血管中的相關(guān)研究，篩選出GSE9371數(shù)據(jù)集［7］。該數(shù)據(jù)來源于美國波士頓大學(xué)生物部門Hansens實(shí)驗(yàn)室，研究者將小鼠分為安慰劑組與雌激素組，每組5個(gè)重復(fù)，在接受長期（1周）的雌激素治療后，提取了小鼠主動(dòng)脈組織中的總RNA進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，以確定長期雌激素治療對綜合基因組的表達(dá)的調(diào)控。樣本數(shù)據(jù)信息見表1。

表1 雌激素在心血管中的相關(guān)研究GSE9371數(shù)據(jù)樣本信息

1.2差異表達(dá)基因分析采用NCBIGEO2R在線分析工具［8］進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析，以安慰劑組為對照組，雌激素組為干預(yù)組。將差異表達(dá)倍數(shù)大于2倍，同時(shí)P＜0.05的基因篩選為差異表達(dá)基因。

1.3 GO富集分析及作圖采用DAVID 6.8從生物學(xué)過程，細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)方面進(jìn)行GO富集分析［9］，以P＜0.05篩選為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO富集結(jié)果。采用R語言ggplot2程序包進(jìn)行可視化繪圖。

1.4通路富集分析及作圖采用DAVID 6.8在REACTOME，BIOCARTA，KEGG_pathway三個(gè)通路數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG富集分析［9］，以P＜0.05篩選為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路富集結(jié)果。采用R語言ggplot2程序包進(jìn)行可視化繪圖［10］。

1.5蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析采用STRING數(shù)據(jù)庫［11］對篩選出的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的分析，隱藏不存在相互作用的節(jié)點(diǎn)，最小相互作用證據(jù)評分設(shè)置為0.4分。此外，采用R語言統(tǒng)計(jì)與其它蛋白相互作用關(guān)系最多的節(jié)點(diǎn)，取前30個(gè)進(jìn)行可視化作圖。采用Cytoscape中的MCODE算法分析［12］，提取其中的核心基因模塊，同樣利用DAVID 6.8對核心模塊基因進(jìn)行GO富集分析及通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1差異表達(dá)基因的分析將雌激素組與安慰劑組基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，按照差異表達(dá)倍數(shù)大于2倍，同時(shí)P＜0.05進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，共篩選到差異表達(dá)基因192個(gè)，按照P值排序，其中前10位的基因?yàn)?Grem2、Ano4、Mmd2、Apod、Galnt15、Heph、Vldlr、Stc1、Vwf和Zmiz1，均為上調(diào)表達(dá)（表2）。

表2 雌激素在心血管中的相關(guān)研究中雌激素組與安慰劑組前10位差異表達(dá)基因

2.2基因功能富集分析基因功能富集分析將上述192個(gè)差異基因映射到生物學(xué)過程，細(xì)胞組分和生物學(xué)功能三個(gè)基因功能數(shù)據(jù)庫中，以P＜0.05篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集結(jié)果，共篩選到100個(gè)顯著相關(guān)的基因功能條目。其中59個(gè)（59%）條目與生物學(xué)過程有關(guān)，涉及脂代謝過程、巨噬細(xì)胞活化調(diào)控過程、紅細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞分化調(diào)控過程、視黃醇代謝過程、血管生成調(diào)控、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)以及細(xì)胞黏附等生物學(xué)功能。20個(gè)（20%）條目與細(xì)胞組分有關(guān)，主要與胞外區(qū)、細(xì)胞外隙、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外外泌體、線粒體等有關(guān)。21個(gè)（21%）條目與分子功能有關(guān)，涉及的分子功能有Wnt蛋白結(jié)合、肝素結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、胰島素樣生長因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等有關(guān)。按照P值排序，其中前10位的基因功能富集結(jié)果條目見圖1。

2.3通路富集分析通路富集分析將上述192個(gè)差異基因映射到BBID、BIOCARTA和KEGG_pathway三個(gè)通路數(shù)據(jù)庫中，以P＜0.05篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集結(jié)果，共篩選到13個(gè)顯著富集的信號(hào)通路，分別是乙醇氧化信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、脂肪酸降解信號(hào)通路、視黃醇類代謝和運(yùn)輸信號(hào)通路以及紅細(xì)胞吸收氧氣并釋放二氧化碳信號(hào)通路等有關(guān)，其中前10位的通路富集結(jié)果條目見圖2。

2.4蛋白質(zhì)相互作用分析我們采用STRING數(shù)據(jù)庫對192個(gè)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)（基因）互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中131個(gè)基因構(gòu)成了互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）。對網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的互作基因的個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，與 Col1a1、Ppargc1a、Cdh2、Ppara、Thbs1等基因存在相互的基因較多，其中前30位的互作基因見圖4。隨后我們使用MCODE算法進(jìn)一步提取了其中的核心子網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中有5個(gè)核心子網(wǎng)絡(luò)（圖5），對每個(gè)核心子網(wǎng)絡(luò)的基因進(jìn)行富集分析后發(fā)現(xiàn)，核心子網(wǎng)絡(luò)1主要與細(xì)胞外基質(zhì)、膽固醇平衡、細(xì)胞外間隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及PPAR信號(hào)通路有關(guān)。核心子網(wǎng)絡(luò)2主要與鈣調(diào)蛋白結(jié)合和胰島素分泌等有關(guān)，核心子網(wǎng)絡(luò)3主要與鐵離子平衡和紅細(xì)胞分化有關(guān)，核心子網(wǎng)絡(luò)4主要與血管新生的調(diào)控有關(guān)，核心子網(wǎng)絡(luò)5主要與生長激素受體信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路有關(guān)（表3）。

3 討論

近年來，我國心血管疾病的發(fā)病率及死亡率均持續(xù)上升，其死亡率居于首位，同時(shí)其在居民死亡的疾病構(gòu)成中占比達(dá)到40%以上，嚴(yán)重威脅居民的生命健康［13］。就性別而言，女性心血管疾病病人的發(fā)病年齡雖然較晚，但病死率及并發(fā)癥的發(fā)生率均高于男性［2］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以影響血脂代謝，對心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用［3-4］。既往研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以通過多種途徑保護(hù)心血管系統(tǒng)，雌激素可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮性和基質(zhì)形成，抑制平滑肌和心肌細(xì)胞的凋亡，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［14-16］。但美國婦女健康倡議活動(dòng)（WHI）研究［6］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用口服雌孕激素替代治療對心血管并沒有保護(hù)作用，甚至?xí)黾咏^經(jīng)后女性患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，關(guān)于雌激素是否可以用于女性心血管疾病的治療以及雌激素對心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制引起廣泛的關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)。

表3 核心子網(wǎng)絡(luò)基因功能及通路富集分析結(jié)果

本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫的挖掘，分析了雌激素作用后血管總RNA中存在顯著差異表達(dá)的基因，通過基因功能與通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因的功能與脂代謝過程、巨噬細(xì)胞活化、脂肪細(xì)胞分化、血管生成、線粒體、胰島素樣生長因子等有關(guān)（圖1），涉及的信號(hào)通路有乙醇氧化信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、脂肪酸降解信號(hào)通路等（圖2）。說明雌激素可能通過這些基因功能與信號(hào)通路影響脂質(zhì)代謝、血管新生以及細(xì)胞生長等生物學(xué)功能。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，192個(gè)差異基因中有131個(gè)基因間存在相互作用關(guān)系，構(gòu)成了互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）。其中核心的子網(wǎng)絡(luò)有5個(gè)，這些核心子網(wǎng)絡(luò)的功能主要與細(xì)胞外基質(zhì)、膽固醇平衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、鈣調(diào)蛋白、胰島素分泌、血管新生、生長激素受體信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路有關(guān)（表3）。核心子網(wǎng)絡(luò)富集到的基因功能與信號(hào)通路與所有基因富集后的結(jié)果基本一致，更加證明了雌激素可能通過這些基因功能與信號(hào)通路對心血管的功能產(chǎn)生影響。對上述雌激素對心血管系統(tǒng)可能的調(diào)控途徑進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，雌激素可能通過調(diào)節(jié)脂代謝［3-4］，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化［17］、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長［18］，激活胰島素樣生長因子［19］，激活PPAR信號(hào)通路［20］等途徑對心血管發(fā)揮保護(hù)作用，而其可能通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化［21］而對心血管產(chǎn)生一定的危害。這些基因功能或信號(hào)通路可作為后續(xù)進(jìn)一步研究的方向，從而明確雌激素在心血管系統(tǒng)中的作用。

圖1 前10位基因功能富集分析 圖2 前10位信號(hào)通路富集結(jié)果 圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖圖4 前30位蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中存在聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)數(shù) 圖5 核心子網(wǎng)絡(luò)圖