四種檢測方法在結(jié)核病診斷中的比較

周秋菊 王冬蓮 楊陽 涂茜 石慶新

[摘要] 目的 比較分析MGIT960液體培養(yǎng)法、結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光探針法）、Xpert MTB/RIF和直接涂片鏡檢在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。 方法 收集我院2019年5～12月臨床上疑似為結(jié)核病患者的各類標(biāo)本。將疑似結(jié)核病患者2天內(nèi)所有的標(biāo)本混勻后進(jìn)行直接涂片鏡檢，然后平均分裝為3份，進(jìn)行MGIT960液體培養(yǎng)、PCR-熒光探針法和Xpert MTB/RIF。 結(jié)果 2019年5～12月間總共收集了我院710份疑似結(jié)核病患者的各類標(biāo)本。直接涂片鏡檢、PCR-熒光探針法、MGIT960液體培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率分別為12.0%、18.7%、21.4%和24.8%。以臨床診斷作為參考標(biāo)準(zhǔn)時，直接涂片法、PCR-熒光探針法、MGIT960液體培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢出結(jié)核分枝桿菌的靈敏度分別為40.2%、60.3%、78.4%和70.1%，而特異度分別為98.6%、96.9%、100.0%和92.2%，且四種方法組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論 四種臨床檢測方法在結(jié)核病診斷中各有優(yōu)缺點，聯(lián)合應(yīng)用可以更好的診斷、治療和監(jiān)測結(jié)核病。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核病;Xpert MTB/RIF;PCR-熒光探針法;MGIT960液體培養(yǎng)法

[中圖分類號] R52? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）16-0008-05

Comparison of four detection methods in the diagnosis of tuberculosis

ZHOU Qiuju? ?WANG Donglian? ?YANG Yang? ?TU Xi? ?SHI Qingxin

Department of Clinical Laboratory， Enze Hospital， Taizhou Enze Medical Center（Group）， Taizhou? 318050， China

[Abstract] Objective To compare and analyze the application of MGIT960 liquid culture method， tuberculosis/non-tuberculous nucleic acid detection（PCR-fluorescent probe method）， Xpert MTB/RIF and direct smear microscopy in the diagnosis of tuberculosis. Methods Various specimens from clinically suspected tuberculosis patients in our hospital from May to December 2019 were collected. All specimens from suspected tuberculosis patients were mixed in two days， then directly smeared for microscopy， and then divided into three equal parts for MGIT960 liquid culture， PCR-fluorescent probe method and Xpert MTB/RIF. Results A total of 710 specimens of suspected tuberculosis patients were collected from our hospital from May 2019 to December 2019. The positive rates of direct smear microscopy， PCR-fluorescent probe method， MGIT960 liquid culture and Xpert MTB/RIF detection of Mycobacterium tuberculosis were 12.0%， 18.7%， 21.4% and 24.8%， respectively. Taking clinical diagnosis as the reference standard， the sensitivity of detecting Mycobacterium tuberculosis by direct smear method， PCR-fluorescent probe method， MGIT960 liquid culture， and Xpert MTB/RIF was 40.2%， 60.3%， 78.4%， and 70.1%， respectively， and the specificity was 98.6%， 96.9%， 100.0%， and 92.2%， respectively， and the differences were statistically significant. Conclusion The four clinical detection methods have their own advantages and disadvantages in the diagnosis of tuberculosis， and the combined application can better diagnose， treat and monitor tuberculosis.

[Key words] Tuberculosis; Xpert MTB/RIF; PCR-fluorescent probe method; MGIT960 liquid culture method

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，是全球死亡人數(shù)最多的單一病原體所致的傳染病，也是全球十大死因之一。主要通過飛沫傳播，可引起肺結(jié)核和肺外結(jié)核。大約90%為成年人，男女比例為2：1。在全球范圍內(nèi)，2018年估計新發(fā)結(jié)核病患者約1000萬（900～1110萬），結(jié)核病死亡人數(shù)約124萬，利福平耐藥結(jié)核病患者約48.4萬，其中耐多藥結(jié)核病患者約占78%[1]。2015～2018年間結(jié)核病的發(fā)病率累計降幅為6.3%，死亡率減少了11%[1]，遠(yuǎn)低于《終止結(jié)核病策略》的目標(biāo)，因此終止結(jié)核病的任務(wù)還是非常艱巨的。為了更多地減少結(jié)核病發(fā)病率和死亡率，需做好預(yù)防外，還需做到早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療。目前結(jié)核病常用的實驗室診斷方法有MGIT960液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF、結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光探針法）和直接涂片鏡檢檢查，通過比較各方法的靈敏度和特異度，為結(jié)核病的診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2019年5～12月間我院接診疑似結(jié)核病患者710例，其中男529例，女181例，男女比例為2.9：1，年齡13～91歲，平均年齡（53.5±18.1）歲。收集痰液標(biāo)本569份，肺泡灌洗液103份，胸水9份，分泌物8份，膿液8份，尿液6份，腹水2份，心包積液2份，腹透液2份，腦脊液1份。結(jié)核病患者納入標(biāo)準(zhǔn)參照結(jié)核病分類（WS 196-2017）[2]和肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 288-2017）[3]。

1.2 試劑和儀器

BACTEC MGIT960全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀、分枝桿菌MGIT培養(yǎng)管和分枝桿菌培養(yǎng)添加試劑盒均購自于美國BD公司;GeneXpert MTB/RIF儀器及Xpert MTB/RIF檢測試劑盒購自于美國Cepheid公司;結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒和晶芯Extractor36核酸快速提取儀由北京博奧生物有限公司提供，實時熒光定量PCR儀（型號7300Plus）由美國Applied Biosystems公司提供;抗酸染色試劑由珠海貝索（BASO）生物技術(shù)有限公司提供;結(jié)核分枝桿菌MPT64抗原由韓國Standard Diagnostics公司提供。

1.3 方法

將疑似結(jié)核病患者2天內(nèi)所有的標(biāo)本混勻后進(jìn)行直接涂片鏡檢，然后平均分裝為3份，進(jìn)行MGIT960液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF檢測和結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光探針法）。

1.3.1 直接涂片鏡檢法? 首先準(zhǔn)備干凈的玻片并做好標(biāo)本序號標(biāo)記，用竹簽挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或血性部分約0.05 mL，于玻片正面均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形痰膜，涂片自然干燥后，酒精燈加熱固定。然后滴加石碳酸復(fù)紅染液蓋滿玻片，染色5 min，流水輕緩沖洗染液，瀝水后自痰膜上端外緣滴加脫色劑蓋滿玻片，脫色1 min，流水沖洗，瀝水，最后滴加亞甲藍(lán)復(fù)染液，染色30 s，流水輕緩沖洗復(fù)染液，瀝水，待玻片干燥后鏡檢。

1.3.2 MGIT960液體培養(yǎng)? 嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作，首先配制2% NALC-NaOH標(biāo)本前處理液，往50 mL離心管中加入等量現(xiàn)配標(biāo)本前處理液消化處理15～20 min后，加無菌PBS（pH6.8）至約50 mL，蓋緊蓋子，混合后離心3000 g×15 min，去上清，加1～3 mL PBS懸浮沉淀，加0.5 mL懸浮液至提前加入0.8 mL分枝桿菌培養(yǎng)添加劑的MGIT培養(yǎng)管中，上機(jī)檢測。培養(yǎng)報陽后的標(biāo)本先進(jìn)行抗酸染色，抗酸染色陽性的進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌MPT64抗原檢測。

1.3.3 Xpert MTB/RIF? 嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作，首先往50 mL離心管中加入等量標(biāo)本體積的樣本前處理液消化處理15～20 min，將處理后的標(biāo)本加入2 mL到檢測匣中，30 min內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測。通過GeneXpert Dx系統(tǒng)測量的熒光信號和內(nèi)設(shè)的算法來判定結(jié)果。

1.3.4 結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測? 嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作，首先在無菌痰杯內(nèi)加入等量的4% NaOH溶液對標(biāo)本進(jìn)行消化處理30 min，然后取1 mL液體加入1.5 mL EP管中，離心12000 r/min×5 min，去上清后加入50 μL核酸提取液，上機(jī)進(jìn)行核酸快速提取。準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)液管，每管加入2 μL標(biāo)本核酸和陰陽性對照品，上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR結(jié)束后，根據(jù)樣品的Ct值判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，采用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Ρ<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過陽性率、靈敏度和特異度等指標(biāo)來比較四種檢測方法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用，其中靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

2 結(jié)果

2.1 四種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率

2019年5～12月間收集了我院710份疑似結(jié)核病患者的標(biāo)本，對其進(jìn)行MGIT960液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF、PCR-熒光探針法和直接涂片檢查時發(fā)現(xiàn)，直接涂片法檢出結(jié)核分枝桿菌的陽性率最低，Xpert MTB/RIF檢出結(jié)核分枝桿菌的陽性率最高，四種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率分別為12.0%、18.7%、21.4%和24.8%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，四種方法檢測結(jié)核分枝桿菌比較

參照肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 288-2017）[3]，研究發(fā)現(xiàn)194例結(jié)核病，其中用直接涂片鏡檢、PCR-熒光探針法、MGIT960液體培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度分別為40.2%、60.3%、78.4%和70.1%，對應(yīng)的特異度分別為98.6%、96.9%、100.0%和92.2%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 四種方法檢測結(jié)核分枝桿菌組間比較

此外，對直接涂片法、PCR-熒光探針法、液體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF進(jìn)行組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩兩方法間存在統(tǒng)計學(xué)差異，見表3～5。

3討論

結(jié)核病的臨床診斷需要根據(jù)臨床癥狀、影像學(xué)特征和實驗室檢查三大方面綜合來判斷。

目前，結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)主要有細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)診斷技術(shù)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)有傳統(tǒng)上的顯微鏡檢查（抗酸染色和熒光染色）和分離培養(yǎng)（固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法）;免疫學(xué)診斷技術(shù)常見的有T-SPOT、MPT64抗原和結(jié)核抗體的檢測;分子生物學(xué)診斷技術(shù)常用的有PCR-熒光探針法、基因芯片法和Xpert MTB/RIF。在本研究中主要是比較分析MGIT960液體培養(yǎng)、PCR-熒光探針法、Xpert MTB/RIF和直接涂片鏡檢法。直接涂片鏡檢法是最簡單的，一臺普通的光學(xué)顯微鏡就可以完成，一般的小醫(yī)院都可以開展，也是最快速的，抗酸染色20 min就好，問題是敏感度相對較差，據(jù)估計，抗酸染色進(jìn)行痰涂片的敏感度為20%～70%，每毫升痰中至少需要105 cfu分枝桿菌才能為陽性，特異性為95%～98%[4]。通常認(rèn)為涂片鏡檢中出現(xiàn)抗酸桿菌的機(jī)會與患者痰中桿菌的數(shù)量呈正比，如果痰中桿菌的數(shù)量小于1000 cfu/mL，涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌的機(jī)會將小于10%[5]。

為了提高靈敏度，建議留取三份不同時間段的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片，且留取的痰標(biāo)本的量最好≥5.0 mL[6]，或?qū)μ禈?biāo)本進(jìn)行離心濃縮、漂白劑濃縮等處理[7]?？顾崛旧栃灾荒苷f明抗酸桿菌的存在，除了結(jié)核分枝桿菌外，還有可能是非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌及個別的細(xì)菌如諾卡菌等。直接涂片法只能證明抗酸桿菌的存在與否，若想進(jìn)一步證實細(xì)菌的死活情況、菌種鑒定及藥物敏感性試驗等，需要進(jìn)行分枝桿菌的培養(yǎng)。培養(yǎng)法是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感性為95%，特異性為98%[4]，在培養(yǎng)法中，痰中最少的分枝桿菌的數(shù)量可低至102 cfu，與抗酸染色相比具有非常高的敏感性[4]。局限性在于固體培養(yǎng)的時間長，一般需要6～8周，為了縮短時間，臨床上常使用的是快速培養(yǎng)法，我們研究中所用到的BACTEC MGIT960系統(tǒng)是全自動的，可連續(xù)監(jiān)測分枝桿菌生長的情況，平均13.2 d報陽，大大縮短了培養(yǎng)時間[8]。據(jù)報道，BACTEC MGIT960和固體培養(yǎng)的污染率分別為5.0%和2.7%，與固體培養(yǎng)比較，液體培養(yǎng)的污染率高[9]。液體培養(yǎng)法報陽說明有分枝桿菌生長，經(jīng)抗酸染色驗證后，需要使用PNB/TCH、MPT64、MALDI-TOF MS和分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行分枝桿菌的菌種鑒定和藥敏試驗，也可以對其進(jìn)行菌種保存用于復(fù)查或科研。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的新方法用于結(jié)核病的輔助診斷。Xpert MTB/RIF是一種基于核酸擴(kuò)增的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，可在2 h內(nèi)檢測是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及是否對利福平耐藥。Xpert MTB/RIF通過檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的利福平抗性決定區(qū)域（RRDR）的突變來判定RIF耐藥性。據(jù)統(tǒng)計，大約95%的利福平耐藥結(jié)核病例在該81 bp區(qū)域中存在突變[10]。Xpert MTB/RIF是一個獨立的，完全集成并自動化進(jìn)行樣本純化、核酸擴(kuò)增、單一或復(fù)雜樣品中目標(biāo)核酸序列檢測的技術(shù)，具有操作簡單、快速、交叉污染低、安全等特點。Xpert MTB/RIF檢出結(jié)核分枝桿菌的最小值為131cfu/mL，不同于分枝桿菌液體培養(yǎng)的檢出限（約10～50 cfu/mL）和涂片顯微鏡的檢出限（約104 cfu/mL）[11]，因此，Xpert MTB/RIF分析的靈敏度比涂片顯微鏡的靈敏度大約高兩個數(shù)量級，類似于固體培養(yǎng)，但不如液體培養(yǎng)敏感。Zong K等[12]通過meta分析得出Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核病的總敏感性為93.0%，特異性為98.0%，靈敏度高于直接涂片法，略低于培養(yǎng)法，特異性和培養(yǎng)法差異不大。Xpert MTB/RIF在肺外結(jié)核病診斷中也具有較好的檢測能力，Vadwai V等[13]發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF對膿液、滑膜液、心包液和腹膜液等標(biāo)本具有良好的敏感性（86%～100%），對淋巴結(jié)組織和胸水等具有中度敏感性（63%～73%），但對腦脊液的敏感性較差（29%）。另外有一篇報道Xpert MTB/RIF在淋巴結(jié)標(biāo)本的敏感性最高（90%;95%CI：86～94），腦脊液敏感性中等（53%;95%CI：28～79），而腹膜液的敏感性較低（32%;95%CI：12～51），胸膜液的敏感性最低（30%;95%CI：17～44）[14]，這種不一致的結(jié)果可能與取材的質(zhì)量和標(biāo)本例數(shù)有關(guān)。Xpert MTB/RIF不足之處主要有無法區(qū)分活性菌和死亡菌，因此不能用于監(jiān)測對治療的反應(yīng)、治療成功、治療失敗或復(fù)發(fā);無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和卡介苗;昂貴;需要定期校準(zhǔn)和維護(hù)等。另外，大約5%的利福平耐藥性不是由rpoB核心區(qū)域內(nèi)的基因突變所致，因此Xpert MTB/RIF檢測利福平的耐藥性時會出現(xiàn)約5%的假陰性[10]。PCR-熒光探針法也是一種分子生物學(xué)診斷技術(shù)，采用實時定量PCR與熒光雜交探針相結(jié)合，對分枝桿菌進(jìn)行定性檢測，可以用于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，操作相對簡單，檢測速度相對較快，只需半天時間即可完成，檢測靈敏度50.3%，特異性98.9%，和抗酸染色比較，靈敏度有所提高[15]。非結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌同歸類于分枝桿菌屬，在細(xì)菌形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分，培養(yǎng)法所需的時間長且需要借助其他的生化或免疫方法加以區(qū)分，加上近年來非結(jié)核分枝桿菌的分離率和患病率呈上升趨勢，每年估計上升2.5%～8%[16]，為了快速的檢測和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，臨床上建議先用PCR-熒光探針法對分枝桿菌進(jìn)行初步鑒定。PCR-熒光探針法的局限性主要有不能區(qū)分活性分枝桿菌和死亡分枝桿菌;不能用于區(qū)分鑒定非結(jié)核分枝桿菌;結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌混合生長時，只能報告結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性;如果引物、探針設(shè)計區(qū)段出現(xiàn)新的突變，可能造成假陰性的結(jié)果。盡管分子生物學(xué)和免疫學(xué)的診斷技術(shù)得到了一定的發(fā)展，但細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)（涂片顯微鏡檢查和分離培養(yǎng)）仍是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是不發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，細(xì)菌學(xué)方法是唯一的可行性技術(shù)。

結(jié)核病患者可分為初治和復(fù)治，初治患者會先選用2HRZE/4HR方案治療6個月，在服藥滿2、5、6個月時進(jìn)行涂片和培養(yǎng)的復(fù)查，而復(fù)治肺結(jié)核患者會在服藥滿2、5、8個月時進(jìn)行復(fù)查。耐藥結(jié)核病患者會在注射期間每個月復(fù)查1次，非注射期間每2個月復(fù)查1次。我們醫(yī)院作為耐藥結(jié)核病診治的定點醫(yī)院，每個月都會接診上百例耐藥結(jié)核病患者。經(jīng)統(tǒng)計，MGIT液體培養(yǎng)陽性的152例標(biāo)本中，有53例耐藥結(jié)核病，耐藥率為34.9%，低于2010年全國結(jié)核病流調(diào)結(jié)果中的42.1%[17]，說明診治有效。研究發(fā)現(xiàn)4種方法中Xpert MTB/RIF檢出結(jié)核分枝桿菌的陽性率最高，而理論上液體培養(yǎng)法的檢出限最低，液體培養(yǎng)法檢出結(jié)核分枝桿菌的陽性率應(yīng)該最高，出現(xiàn)這種矛盾的結(jié)果與Xpert MTB/RIF不能區(qū)分活性菌和死亡菌有關(guān)。肺結(jié)核患者經(jīng)過早期聯(lián)合適量規(guī)律的合理治療后，結(jié)核分枝桿菌被抑制或被殺滅，液體培養(yǎng)法為陰性時，Xpert MTB/RIF可能還檢出極少量的死亡菌株。因此，Xpert MTB/RIF不能用于結(jié)核病治療的監(jiān)測。直接涂片法檢出結(jié)核分枝桿菌的陽性率最低，與直接涂片法的檢出限高，需要較多的分枝桿菌時才會出現(xiàn)陽性有關(guān)。PCR-熒光探針法和Xpert MTB/RIF為分子生物學(xué)診斷技術(shù)，通過PCR對結(jié)核分枝桿菌核酸進(jìn)行擴(kuò)增后，靈敏度大幅提高。以臨床診斷作為參考標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)直接涂片法的靈敏度為40.2%，低于Vadwai V等[13]研究中的51%，高于Al-Ateah SM等[18]報道的33.3%和Malbruny B等[19]報道的28.6%，遠(yuǎn)低于Habous M等[20]報道的67.31%。PCR-熒光探針法的靈敏度為60.3%，高于梁建琴等[15]報道的50.3%，低于梁雪妮等[21]報道的87.5%。液體培養(yǎng)法的靈敏度為78.4%，低于Azadi D等[4]報道的95%。Xpert MTB/RIF的靈敏度為70.1%，低于Vadwai V等[13]報道的83%和Al-Ateah SM等[18]報道的94.4%。我們研究中液體培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度相對較低，可能與疑似結(jié)核病患者中診斷為結(jié)核病的例數(shù)較少有關(guān)。總體上，液體培養(yǎng)法的靈敏度最高，其次為Xpert MTB/RIF，最低的為直接涂片法;特異性最高的為液體培養(yǎng)法，其次為直接涂片法，因此Xpert MTB/RIF聯(lián)合直接涂片法、Xpert MTB/RIF可以快速準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，液體培養(yǎng)法可以對結(jié)核病的治療進(jìn)行臨床指導(dǎo)和評價，PCR-熒光探針法可以快速有效的鑒別MTB和NTM。

由于直接涂片法的靈敏度較差，培養(yǎng)法的周期較長，臨床上更多的依賴于分子生物學(xué)的快速檢測，Xpert MTB/RIF具有較高的靈敏度和特異度，能準(zhǔn)確的診斷結(jié)核，還能判斷利福平是否耐藥，應(yīng)用越來越多。分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不足在于不能區(qū)分活性菌和死亡菌，不能用于結(jié)核病治療的監(jiān)測。針對這個問題，研究人員正在嘗試著開發(fā)一個新的方案，通過對痰標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，防止非活性結(jié)核分枝桿菌中的DNA被擴(kuò)增。還有正在評估的一個替代方法，將DNA檢測改為RNA檢測。通過全人類的不斷努力，相信未來會真正的實現(xiàn)和完成《終止結(jié)核病策略》的目標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2019[R]. World Health Organization，Geneva，Switzerland， 2019.

[2] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-結(jié)核病分類（WS 196-2017）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2017.

[3] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 288-2017）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2017.

[4] Azadi D，Motalebirad T，Ghaffari K，et al. Mycobacteriosis and Tuberculosis：Laboratory Diagnosis[J]. The Open Microbiology Journal，2018，12（1）：41-58.

[5] Mathew P，Kuo YH，Vazirani B，et al. Are three sputum acid-fast bacillus smears necessary for discontinuing tuberculosis isolation？[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（9）：3482-3484.

[6] Warren JR，Bhattacharya M，De Almeida KN，et al. A Minimum 5.0 ml of Sputum Improves the Sensitivity of Acid-fast Smear for Mycobacterium tuberculosis[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2000，161（5）：1559-1562.

[7] Rasool G，Riaz M，Mehmood Z，et al. Effects of household bleach on sputum smear microscopy to concentrate acid fast bacilli for the diagnosis of pulmonary tuberculosis[J]. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents，2018，32（3）：607-611.

[8] Roy A，Baveja CP，Kumar S. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the Automated BACTEC MGIT 960 System and Lowenstein-Jensen Medium in clinically suspected cases of tubercular meningitis in children[J].International Journal of Biomedical and Advance Research，2016，7（2）：94-96.

[9] Zhao P，Yu Q，Chen L，et al. Evaluation of a liquid culture system in the detection of mycobacteria at an antituberculosis institution in China; A retrospective study[J]. Journal of International Medical Research，2016，44（5）：1055-1060.

[10] Van Der Zanden AG，Te Koppele-Vije EM，Vijaya Bhanu N，et al. Use of DNA Extracts from Ziehl-Neelsen-Stained Slides for Molecular Detection of Rifampin Resistance and Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2003，41（3）：1101-1108.

[11] Helb D，Jones M，Story E，et al. Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand，Near-Patient Technology[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（1）：229-237.

[12] Zong K，Luo C，Zhou H，et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of rifampicin resistance in different regions：a meta-analysis[J]. BMC Microbiol，2019，19（1）：177.

[13] Vadwai V，Boehme C，Nabeta P，et al. Xpert MTB/RIF：a New Pillar in Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis？[J].Journal of Clinical Microbiology，2011，49（7）：2540-2545.

[14] Tadesse M，Abebe G，Bekele A，et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis：a diagnostic evaluation study[J].Clin Microbiol Infect，2019， 25（8）：1000-1005.

[15] 梁建琴，高華方，李洪敏，等. PCR-熒光探針法快速檢測結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌[C]. 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會2011年學(xué)術(shù)會議論文匯編，2011.

[16] Adjemian J，Daniel-Wayman S，Ricotta E，et al. Epidemiology of Nontuberculous Mycobacteriosis[J]. Semin Respir Crit Care Med，2018，39（3）：325-335.

[17] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

[18] Al-Ateah SM，Al-Dowaidi MM，El-Khizzi NA. Evaluation of direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory and non-respiratory clinical specimens using the cepheid gene xpert system[J]. Saudi Med J，2012，33：1100-1105.

[19] Malbruny B，Le Marrec G，Courageux K，et al. Rapid and efficient detection of mycobacterium tuberculosis in respiratory and non-respiratory samples[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2011，15：553-555.

[20] Habous M，E Elimam MA，Kumar R，et al. Evaluation of GeneXpert Mycobacterium tuberculosis/Rifampin for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex and rifampicin resistance in nonrespiratory clinical specimens[J].Int J Mycobacteriol，2019，8（2）：132-137.

[21] 梁雪妮，盛翔宇，孫炳奇，等. PCR-熒光探針法檢測分枝桿菌的臨床應(yīng)用價值[J]. 中國實驗診斷學(xué)，2014，18（1）：99-101.

（收稿日期：2020-01-07）