巴戟天醇提物的提取優(yōu)化及其抗氧化活性研究

林立 王建榮 鄭燕梅

【摘 要】 目的：優(yōu)化巴戟天醇提物的提取工藝，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。方法：對(duì)巴戟天醇提物的提取進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，然后通過清除ABTS、清除DPPH、清除超氧陰離子、還原力和總抗氧化五種方法評(píng)價(jià)巴戟天體外抗氧化活性。結(jié)果：最佳提取條件為乙醇提取濃度75 %，提取溫度100 ℃，提取時(shí)間2 h;巴戟天75 %醇提物對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的最大清除率分別為48.016 %和28.782 %，還原力測(cè)試與總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)數(shù)值均與濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。結(jié)論：巴戟天具有一定的體外抗氧化活性。

【關(guān)鍵詞】 巴戟天;抗氧化;自由基

【中圖分類號(hào)】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）12-0042-05

Abstract：Objective Optimize the extraction process of alcohol extraction from Morinda officinalis and evaluate its antioxidant activity in vitro.Methods The alcohol extraction of Morinda officinalis was analyzed by single factor experiment，and then the antioxidant activity of Morinda officinalis was evaluated by five methods which were scavenging ABTS，removing DPPH，removing superoxide anion，reducing force and total antioxidant capacity. Results The optimum extraction conditions were ethanol extraction concentration 75 %，extraction temperature 100 ℃，extraction time 2 h，The part of 75 % alcohol extraction had some scavenging ability for ABTS radical，DPPH radical and superoxide anion radical，and the maximum scavenging rate for DPPH radical and superoxide anion radical was 48.016 % and 28.782 %，respectively. The experimental values of reducing force test and total antioxidant capacity showed a quantitative effect relationship with the concentration.Conclusior Morinda officinalis has antioxidant activity in vitro.

Keywords：Morinda officinalis How; Antioxidant Activity; Free Radical

巴戟天（Morinda officinalis How）是茜草科巴戟天屬多年生攀援性木質(zhì)藤本植物，別名巴戟、巴吉、雞腸風(fēng)，產(chǎn)福建、廣東、海南、廣西等省區(qū)的熱帶和亞熱帶地區(qū)，中南半島也有分布[1]。全年均可采挖，洗凈，除去須根，其肉質(zhì)根的根肉曬干即成藥材“巴戟天”，和檳榔、益智、砂仁并稱為我國(guó)四大南藥，為福建省大宗道地藥材。中醫(yī)認(rèn)為其性甘、辛、微溫，歸腎、肝經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功能，可用于陽(yáng)痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛，筋骨痿軟等病癥[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)巴戟天屬植物的化學(xué)成分及藥理活性研究較多，其化學(xué)成分主要有蒽醌類、萘醌和萘氫醌類、環(huán)烯醚萜類、糖類、木脂素類、脂肪苷類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類等，并不斷有新的化學(xué)成分被發(fā)現(xiàn);現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明巴戟天能夠抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗丙型肝炎病毒作用、抗疲勞、保肝、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控生精功能、抗腫瘤及細(xì)胞毒作用、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化等生物活性[3-9]。對(duì)于巴戟天的提取有多種方式，一般有水提取法、酸堿提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、酶解法、微波提取法等，這些方法雖然提取率較高，但存在條件要求嚴(yán)格，操作復(fù)雜，成本較高等問題，個(gè)別方法又會(huì)破壞巴戟天的活性[10]。而對(duì)于單純乙醇提取的方法還少有提及，而且其實(shí)驗(yàn)成本較低，操作簡(jiǎn)單，提取物易于保存，因而選用乙醇為溶劑對(duì)巴戟天進(jìn)行提取，研究巴戟天醇提物的生物活性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，人體內(nèi)多余的自由基，會(huì)破壞人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)的過氧化，進(jìn)而干擾人體正常的代謝活動(dòng)，引發(fā)疾病、加速人體衰老[11]。開發(fā)和利用高效無(wú)毒的天然抗氧化劑是一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，目前對(duì)巴戟天的體外抗氧化研究相對(duì)較少，特別是醇提取物的抗氧化活性研究比較缺乏，為了進(jìn)一步發(fā)掘巴戟天的用藥潛能，探究其抗氧化能力，本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)行總抗氧化能力、DPPH自由基清除活性、還原力、ABTS自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性五種方法對(duì)巴戟天的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為巴戟天的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 巴戟天藥材為野外人工采集，采集點(diǎn)位于福建省南靖縣，采集植物經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)楊成梓教授鑒定，認(rèn)定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的根。

1.2 試劑 ABTS、DPPH、NADH、NBT、PMS（美國(guó)Sigma公司）;磷酸鈉（聯(lián)試化工試劑有限公司）;硫酸（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）;十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;三氯乙酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠）;鉬酸銨、乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器 DZF-6050電熱恒溫真空干燥箱（中新醫(yī)療儀器有限公司）;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮公司）;HH80數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）;循環(huán)水式多用真空泵、低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科技工貿(mào)有限公司）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;多功能食品加工粉碎機(jī)（上海帥佳電子科學(xué)儀器廠）;千分之一天平（上海舜宇恒豐科學(xué)儀器有限公司）;萬(wàn)分之一天平（福建省計(jì)量科技研究所）;十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽多利斯）;紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津制作所）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離 將巴戟天洗凈，置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥12 h，粉碎，過篩。采用熱溶劑提取法提取巴戟天醇提物，將藥液靜置一段時(shí)間后真空抽濾，合并兩次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮，溫度保持30 ℃，回收乙醇至無(wú)醇味。取一定量巴戟天醇提物于真空干燥箱中烘干，備用。在巴戟天提取物的提取過程中主要涉及的因素是提取時(shí)的溶劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)分別探索它們對(duì)提取過程的影響，優(yōu)化巴戟天的提取過程。

2.1.1 乙醇濃度對(duì)巴戟天醇提物得率的影響 稱取巴戟天干燥物各等分，在溫度100 ℃條件下，提取2 h，分別使用55、65、75、85、95 %的乙醇溶劑進(jìn)行提取，計(jì)算乙醇濃度對(duì)巴戟天醇提物得率，三次重復(fù)試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)巴戟天醇提物得率的影響 用75 %乙醇回流提取，每次2 h，分別在70、80、90、100、110 ℃進(jìn)行提取，計(jì)算提取溫度對(duì)巴戟天醇提物得率，三次重復(fù)試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)巴戟天醇提物得率的影響 在溫度100 ℃條件下，用75 %乙醇回流提取，分別提取1、1.5、2、2.5、3 h，計(jì)算時(shí)間對(duì)巴戟天醇提物得率，三次重復(fù)試驗(yàn)。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 總抗氧化能力測(cè)定[12] 取0.25、0.5、1 mg/mL濃度的樣品溶液各0.3 mL（31.25～500 μg/mL）;加入3 mL的反應(yīng)液（含0.6 M的硫酸，28 mM的磷酸鈉和4 mM的鉬酸銨），置于95 ℃的水浴中反應(yīng)90 min，冷卻至室溫后，在紫外695 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（Ai），以BHT為陽(yáng)性對(duì)照。各濃度樣品均重復(fù)以上步驟3次，并記錄數(shù)值。80 %乙醇替代樣品溶液作空白調(diào)零。

2.2.2 DPPH清除活性[13] 取5、10、20 mg/mL濃度的樣品溶液各2 mL，加入0.2 mol/L DPPH溶液2 mL，混勻后，置暗處30 min，使其充分反應(yīng)，在紫外波長(zhǎng)517 nm下分別測(cè)取各濃度吸光度（Ai），以Vc為陽(yáng)性對(duì)照。各濃度樣品均重復(fù)以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以80 %乙醇替代樣品溶液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度（A0）。

公式：DPPH自由基清除率（%）=[（A0-Ai）/A0]×100

式中：A0為空白對(duì)照吸光值;Ai為樣品吸光值。

2.2.3 還原力測(cè)定 [13] ?取2.5、5、10 mg/mL濃度的樣品溶液各2.5 mL，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL的1 %鐵氰化鉀溶液，充分混勻，置于50 ℃條件下水浴保溫20 min;加入2.5 mL的10 %三氯乙酸，搖勻并靜置10 min;取5 mL混合溶液，加入5 mL蒸餾水與1 mL的0.1 %氯化鐵，搖勻并靜置10 min，在紫外700 nm波長(zhǎng)處測(cè)取各濃度吸光度（Ai）。各濃度樣品均重復(fù)以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以2.5 mL的80 %乙醇替代樣品溶液作空白調(diào)零。

2.2.4 ABTS清除活性[14] 實(shí)驗(yàn)用ABTS+溶液的制備：取等體積7 mM的ABTS與2.45 mM過硫酸鉀充分混勻，置23 ℃暗處反應(yīng)12～16 h，得到ABTS+。加入80 %乙醇稀釋，使ABTS+溶液在紫外波長(zhǎng)734 nm下的吸光值在（0.7±0.02）之間。

取10、20、40 mg/mL樣品溶液各0.1 mL，分別加入ABTS+（吸光度在0.7±0.02內(nèi)）溶液3.9 mL，充分混勻，置23 ℃反應(yīng)6 min，在紫外734 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)取各濃度吸光度（Ai）。各濃度樣品均重復(fù)以上步驟3次，并記錄數(shù)值。用80 %乙醇溶液替代樣品溶液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度（A0）。

公式：ABTS自由基清除率（%）=（A0-Ai）×100/A0

式中：A0為空白吸光值;Ai為樣品吸光值。

2.2.5 超氧陰離子清除活性[15] 取0.25、0.5、1 mg/mL不同濃度的樣品溶液各1 mL，于體系中加入1 mL NBT溶液[156 μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制]，1 mL NADH溶液[468 沒μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制]，混勻，反應(yīng)從加入1 mL PMS溶液[60 μmol/L，由0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制]開始，置室溫反應(yīng)5 min，在紫外波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定各濃度樣品Ai值。各濃度樣品均重復(fù)以上步驟3次，并記錄數(shù)值。以80 %乙醇替代樣品溶液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度（A0）。以0.1 M的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）調(diào)零。

公式：超氧陰離子清除率（%）=100×[A0-（Ai-Aj）]/A0

式中：A0為空白吸光值;Ai為樣品吸光值;Aj為樣品對(duì)照吸光值。

3 結(jié)果

3.1 優(yōu)化巴戟天醇提物的提取過程

3.1.1 乙醇濃度對(duì)巴戟天醇提物得率的影響 乙醇濃度在55 %～75 %的濃度范圍內(nèi)，巴戟天的醇提物得率隨著乙醇濃度的升高而增大，在75 %處有最大得率，為7.17 %，但隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，得率沒有發(fā)生太大的變化。因而以下實(shí)驗(yàn)中，選擇75 %的乙醇作為提取濃度進(jìn)行提取。如圖1所示。

3.1.2 提取溫度對(duì)巴戟天醇提物得率的影響 巴戟天醇提物的得率隨著溫度的升高而增大，呈一定的量效關(guān)系，但是過高的溫度可能會(huì)使雜質(zhì)的溶出度增加，破壞巴戟天抗氧化物的生物活性[16]，因而以下實(shí)驗(yàn)中，選擇100 ℃為提取溫度進(jìn)行提取。如圖2所示。

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)巴戟天醇提物得率的影響 巴戟天醇提物的得率隨著提取時(shí)間的改變，雖然時(shí)間越久，得率越高，但2 h后開始趨近于平穩(wěn)，時(shí)間越久需要耗費(fèi)更多的財(cái)力物力，因而以下實(shí)驗(yàn)中，因而選擇2 h作為提取時(shí)間進(jìn)行提取。如圖3所示。

3.2 巴戟天醇提物的抗氧化實(shí)驗(yàn)

3.2.1 總抗氧化能力 鉬酸銨法通過配制H2SO4、Na3PO4和H8MoN2O4三種溶液，形成磷鉬復(fù)合物，使用紫外分光光度法通過測(cè)試溶液吸光度的變化，從而對(duì)抗氧化能力進(jìn)行定量分析。由圖4可知，吸光度A在1 mg/mL處數(shù)值為1.134，吸光度隨著樣品濃度的增大而增大，說(shuō)明巴戟天75 %醇提取物有一定的總抗氧化能力。如圖4所示。

3.2.2 DPPH自由基清除能力 DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是以N為中心，一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，在波長(zhǎng)400～600 nm之間為中心處具有強(qiáng)烈的吸收，因此在溶液中呈現(xiàn)深紫色。與抗氧化劑單電子配對(duì)之后會(huì)褪色為無(wú)色或淺黃色，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關(guān)系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。隨著藥物濃度的增加，吸光度變小，清除率變大，當(dāng)巴戟天75 %醇提取物濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率為48.016 %，說(shuō)明巴戟天75 %醇提取物有清除DPPH自由基的能力。如圖5所示。

3.2.3 還原力 還原力強(qiáng)的物質(zhì)供應(yīng)的電子可與自由基反應(yīng)，使自由基成為穩(wěn)定的物質(zhì);當(dāng)體系中存在還原性物質(zhì)時(shí)，鐵氰化鉀會(huì)被還原成亞鐵氰化鉀，F(xiàn)e3+還原為Fe2+，該產(chǎn)物與三氯化鐵反應(yīng)，生成普魯士藍(lán)（Fe4[Fe（CN）6]3），其在紫外波長(zhǎng)700 nm處有最大吸收峰，抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)，則測(cè)量的吸光度越大。因此其抗氧化活性的能力可根據(jù)還原力的大小來(lái)進(jìn)行判斷。吸光度A隨著樣品濃度的增大而增大，呈量效關(guān)系，在10 mg/mL濃度下，吸光度為0.194，說(shuō)明巴戟天75 %醇提取物含有抗氧化物質(zhì)，具有一定的還原能力。見表1。

3.2.4 ABTS自由基清除作用 ABTS（2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）被過硫酸鉀氧化后，可生成藍(lán)綠色的陽(yáng)離子自由基ABTS+，該自由基在紫外波長(zhǎng)734 nm處有最大吸收峰。當(dāng)抗氧化劑有清除該自由基的能力時(shí)，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關(guān)系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。隨著藥物濃度的增加，吸光度變小，清除率變大，當(dāng)濃度在40 mg/mL時(shí)，清除率為8.858 %達(dá)到最高，說(shuō)明巴戟天75 %醇提取物具有清除ABTS的活性，具有還原能力的物質(zhì)存在。見表2。

3.2.5 超氧陰離子自由基清除作用 NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）在560 nm處有最大吸收峰。當(dāng)抗氧化劑有清除該自由基的能力時(shí)，其吸光值的改變與抗氧化劑的清除能力成定量關(guān)系，溶液顏色隨著該自由基的減少而變淺，吸光度降低，因而可用分光光度法對(duì)被測(cè)物質(zhì)的還原能力進(jìn)行定量分析。在1 mg/mL濃度條件下，巴戟天75 %醇提取物的清除率達(dá)到28.782 %，說(shuō)明其對(duì)超氧陰離子有一定的清除作用，并且隨著樣品濃度的增大，清除率也跟著增大。見表3。

4 討論

巴戟天作為福建本土的道地藥材，具有很高的藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)其的開發(fā)與利用一直是研究熱點(diǎn)。特別是近年來(lái)人們對(duì)人體健康的重視，從天然藥物中尋找抗氧化劑亦是一個(gè)研究的方向。自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為，生物體內(nèi)多余的自由基會(huì)使機(jī)體器官產(chǎn)生衰退性變化。在正常情況下，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除會(huì)達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，但內(nèi)源性的抗氧化物防御機(jī)制不足以應(yīng)對(duì)由于衰老帶來(lái)的自由基，行之有效的辦法是通過補(bǔ)充體外抗氧化劑來(lái)減少生物體長(zhǎng)期積累的氧化損傷[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴戟天醇提物對(duì)ABTS自由基、超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，活性不是很顯著，但是能夠清除DPPH自由基，具有良好的總抗氧化能力和還原能力，表明巴戟天醇提部位存在清除自由基的物質(zhì)，但還需要對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)一步的研究。細(xì)胞以及動(dòng)物模型的測(cè)定值比體外化學(xué)提取法更具有生物相關(guān)性。為了能深入分析巴戟天活性物質(zhì)在生物體內(nèi)抗氧化的生物利用率及其物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)還需要利用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型來(lái)做進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)

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