辛伐他汀聯(lián)合阿侖膦酸鈉對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響

吳瓊

勝利油田中心醫(yī)院關(guān)節(jié)運(yùn)動醫(yī)學(xué)科，山東 東營 257000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退變破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、骨力學(xué)強(qiáng)度下降，易于發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病[1]。OP是老年人普遍存在的健康問題之一，因其常常合并嚴(yán)重并發(fā)癥，且預(yù)后不良，嚴(yán)重危害老年人的健康和生活生存質(zhì)量。目前防治OP主要有雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、降鈣素、雙膦酸鹽類、甲狀旁腺激素(PTH)、氟化物等藥物[2]。研究表明他汀類藥物具有促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，抗骨質(zhì)疏松作用，開啟了他汀類藥物臨床防治OP的新領(lǐng)域[3]。前期研究表明阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀對去勢大鼠骨質(zhì)疏松起到很好的抗OP作用[4]。本研究探討應(yīng)用辛伐他汀聯(lián)合阿侖膦酸鈉對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝的影響，為防治OP提供價(jià)廉有效的治療模式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級雌性SD大鼠60只，3月齡，體重(330±20) g，訂購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號：SYXK(京)2018-0035)，辛伐他汀片(舒降之)：(40 mg/片，生產(chǎn)批號：J20181021，美國默沙東制藥有限公司)，阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg/片，生產(chǎn)批號：J20180085，美國默沙東制藥有限公司)。EXPERT型雙能X線骨密度測定儀購于美國LUNAR公司，血清鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒購于南京建成生物公司；血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、I型膠原羧基末端肽(ICIP)、γ-羧基谷氨酸(GLA)I型前膠原羧基端前肽(PICP)檢測試劑盒購于上海譜振生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理：60只雌性SD大鼠按隨機(jī)法分為：假手術(shù)組、去勢組、辛伐他丁組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組。假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，其他4組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。造模成功后第2天給予藥物干預(yù)。假手術(shù)組和去勢組：(灌胃，等量0.9% Nacl)；辛伐他汀組：辛伐他汀片[灌胃，4 mg/(kg·d)]；阿侖膦酸鈉組：阿侖膦酸鈉片[灌胃，0.5 mg/(kg·d)]；聯(lián)合藥物組：辛伐他汀片[灌胃，4 mg/(kg·d)]，阿侖膦酸鈉片[灌胃，5 mg/(kg·d)]，用藥8周。

1.2.2構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松動物模型：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm雙背側(cè)縱行切口，依次分離進(jìn)入腹腔，沿輸卵管尋找卵巢，平鑷將卵巢牽出，完整切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織，不予切除卵巢和結(jié)扎輸卵管，術(shù)后逐層縫合關(guān)閉腹腔。造模成功評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：造模8周后骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。

1.2.3標(biāo)本取材與處理：藥物干預(yù)8周，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血6～8 mL，高速冷凍離心，3 000 r/min×10 min，收集上層血清1～2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饘觿冸xL4腰椎和雙側(cè)股骨，剔除周圍軟組織，以無菌生理鹽水濕紗布包裹，-20 ℃保存?zhèn)溆?。另留取股?0%甲醛溶液固定，10% EDTA 6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，制成石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4檢測血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)：取出上清液，采用ELISA法檢測各組大鼠血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)：骨礦化指標(biāo)：Ca、P；骨形成生化指標(biāo)：PICP、BGP和ALP；骨吸收生化指標(biāo)：ICIP、GLA和StrACP，嚴(yán)格按試劑盒說明操作檢測血清學(xué)指標(biāo)。

1.2.5檢測血清抗氧化應(yīng)激生化指標(biāo)：取出上清液，采用ELISA法檢測各組大鼠血清抗氧化應(yīng)激指標(biāo)：SOD、MDA和CAT，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

1.2.6檢測骨組織BMD：取出待測大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，應(yīng)用軟件分析計(jì)算BMD值。

1.2.7HE染色觀察股骨形態(tài)學(xué)：取出石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，流水反復(fù)沖洗，蘇木精染色10 min，流水沖洗，0.5%～1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗30 min，返藍(lán)，蒸餾水洗滌3～5 s；0.5%伊紅染液染色2～3 min，流水沖洗；再次脫水、透明，封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清骨礦化生化指標(biāo)

去勢組大鼠血清Ca和P水平較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組血清Ca和P水平較去勢組均升高，以聯(lián)合用藥組升高最顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清骨礦化生化指標(biāo)比較

2.2 血清骨形成生化指標(biāo)

去勢組大鼠血清ALP、BGP、PICP水平較假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)，辛伐他汀組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組血清ALP、BGP、PICP水平較去勢組均降低，以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P<0.05)。見表2。

2.3 血清骨吸收生化指標(biāo)

去勢組大鼠血清TRAP、GLA、ICIP水平較假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)，辛伐他汀組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組血清TRAP、GLA、ICIP水平較去勢組均降低，以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠血清骨形成生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation among rats in each group

表3 各組大鼠血清骨吸收生化指標(biāo)比較Table 3 Comparison of serum biochemical markers of bone resorption among rats in each group

2.4 血清氧化應(yīng)激生化指標(biāo)

去勢組大鼠血清SOD、CAT較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組較去勢組血清SOD、CAT均增高，其中以聯(lián)合藥物組增高最顯著(P<0.05)。而去勢組大鼠血清MDA較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)，辛伐他汀組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組較去勢組血清MDA均降低，以聯(lián)合藥物組降低最顯著(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較Table 4 Comparison of serum oxidative stress indicators among rats in each group

2.5 骨組織BMD

去勢組腰椎和股骨BMD較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、阿侖膦酸鈉組、聯(lián)合藥物組較去勢組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中以聯(lián)合藥物組增高最顯著(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠骨組織BMD比較

2.6 骨組織形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組股骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨小梁致密粗壯，排列整齊，連接網(wǎng)狀，脂肪細(xì)胞少。去勢組股骨組織骨小梁明顯減少，稀疏，部分纖細(xì)或出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，連接不完整，大量纖維組織，髓腔內(nèi)大量空泡狀脂肪細(xì)胞。辛伐他汀組和阿侖膦酸鈉組骨小梁數(shù)量增多，排列尚規(guī)則，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)略微修復(fù)，結(jié)構(gòu)仍不完整，脂肪細(xì)胞變少。聯(lián)合藥物組骨組織結(jié)構(gòu)較完整，骨小梁數(shù)目明顯增多，粗細(xì)均勻致密，立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，脂肪細(xì)胞明顯減少。見圖1。

圖1 HE染色觀察股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢組；C：辛伐他汀組；D：阿侖膦酸鈉組；E：聯(lián)合藥物組Fig.1 HE staining observation of morphological changes of the femurs (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Simvastatin group; D: Alendronate group; E: Combination group

3 討論

OP是嚴(yán)重危害中老年人身體健康的一種疾病，較常見于絕經(jīng)后婦女，臨床表現(xiàn)：①骨量減少，如骨礦物質(zhì)、骨基質(zhì)等減少。②骨組織微結(jié)構(gòu)退變，骨小梁數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)破壞、變細(xì)變薄和斷裂。③骨組織生物力學(xué)改變(如骨力學(xué)強(qiáng)度下降、載荷承受力降低、骨脆性增高)，骨折危險(xiǎn)性增加易于發(fā)生骨折[5]。目前防治OP的藥物種類繁多，作用特點(diǎn)不同，但在療效、副作用和安全性等方面存在很多問題[6]。雌激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)目前已普遍應(yīng)用于防治OP，但長期HRT會增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、靜脈血栓及陰道出血的發(fā)生率[7]。因此，尋找防治骨質(zhì)疏松的聯(lián)合用藥對改善OP預(yù)后有重大意義。

他汀類藥物屬3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)抑制劑，具有刺激成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成，增加骨密度，恢復(fù)微結(jié)構(gòu)，增加其強(qiáng)度，減少骨折危險(xiǎn)等作用[8-9]。辛伐他汀通過多條途徑既能促進(jìn)骨形成，又抑制骨吸收，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。其主要作用機(jī)制：①促進(jìn)骨形成：通過促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因表達(dá)，增強(qiáng)ALP和骨鈣素(osteocalcin，OC)的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，骨基質(zhì)形成和礦化過程，介導(dǎo)骨形成；誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，發(fā)揮強(qiáng)大的成骨作用，增加骨量，修復(fù)骨微結(jié)構(gòu)[10]。②抑制骨吸收：抑制膽固醇合成HMG-CoA還原酶抑制破骨細(xì)胞的作用，其與二膦酸鹽作用于同一路徑的不同位點(diǎn)，抑制破骨細(xì)胞功能，抑制骨吸收[11]。

阿侖膦酸鈉屬第三代二膦酸鹽(Bisphosphonates，BPs)類藥物，具有強(qiáng)力抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換、預(yù)防骨量丟失、增加骨量和減少骨折發(fā)生的作用，是首個(gè)以骨質(zhì)疏松為適應(yīng)證而獲準(zhǔn)上市的BPs[12]。阿侖膦酸鈉可直接結(jié)合破骨細(xì)胞膜表面的ATP類似物，抑制ATP-依賴性細(xì)胞內(nèi)酶，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，影響其分化和活性，進(jìn)而使其凋亡，抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換率[13]。且阿侖膦酸鈉對成骨細(xì)胞無作用，故不影響骨形成和骨礦化，骨質(zhì)仍正常。

Ca、P、ALP、BGP、PICP、TRAP、GLA、ICIP等骨代謝相關(guān)指標(biāo)作為評價(jià)判斷骨形成、骨吸收和骨轉(zhuǎn)換的常用指標(biāo)，與BMD相結(jié)合，有利于OP的診斷、治療及病情評估。SOD、MDA和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠有效清除過氧化產(chǎn)生各種活性自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)研究證實(shí)氧化應(yīng)激也是OP的重要發(fā)病機(jī)制[14]。他汀類和雙膦酸鹽類藥物可共同作用于甲羥戊酸途徑，通過抑制HMG-CoA還原酶發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞的作用[15]。本研究證明辛伐他汀、阿侖膦酸鈉聯(lián)合干預(yù)可調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨代謝，抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加骨密度，改善骨組織結(jié)構(gòu)，具有較好的抗骨質(zhì)疏松作用。同樣，許大勇等[4]研究表明阿侖膦酸鈉、辛伐他汀兩藥聯(lián)合具有協(xié)同抗骨質(zhì)疏松作用。嚴(yán)鵬霄[16]研究表明阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀可改善骨生化指標(biāo)，聯(lián)合應(yīng)用有更明顯的防治OP作用。鄧訓(xùn)訓(xùn)等[17]研究表明阿托伐他汀聯(lián)合阿侖膦酸鈉能有效提高高齡骨質(zhì)疏松改善骨代謝，增加骨密度。

綜上所述，辛伐他汀聯(lián)合阿侖膦酸鈉可調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝，抗氧化應(yīng)激，增加骨密度，改善骨組織結(jié)構(gòu)，具有抗骨質(zhì)疏松作用。目前兩藥防治OP的效果是肯定的，有著不可忽視的作用。但是，他汀類和二膦酸鹽藥物對骨代謝的具體作用分子機(jī)制尚未完全明確，可能還有尚未認(rèn)知的抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。