強筋健骨方對PMOP大鼠骨密度及生物力學影響的實驗研究

樓家暉 楊鶇祥 鄭明軒 楊永菊 王洪旭

1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032 2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以成熟骨量減少，骨組織結(jié)構(gòu)破壞，骨強度受損，極易發(fā)生骨痛等疾病的全身性骨病。研究表明[1]，現(xiàn)有的西藥、雌激素等防治手段具有誘導(dǎo)惡性腫瘤、骨壞死等不良反應(yīng)，而中藥復(fù)方具有整體治療及副作用小的優(yōu)點，是防治骨質(zhì)疏松癥的新方向。臨床實踐證實，中醫(yī)“腎主骨生髓”“肝主筋”理論指導(dǎo)下的中藥復(fù)方對骨密度(bone mineral density，BMD)增加、成骨細胞的形成及骨生物力學特性具有促進作用[2-5]。本實驗通過研究“強筋健骨方”對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)大鼠骨密度及生物力學的影響，為下一步臨床試驗提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用60只3月齡未經(jīng)產(chǎn)雌性SD大鼠，體質(zhì)量(204±16) g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：SCXK(遼).2015-0001。

1.2 藥物與試劑

強筋健骨方配制：組成：淫羊藿、懷牛膝等。用去離子水將顆粒配置成藥液，于4℃冰箱密封保存，灌胃前水浴法加熱至37℃，超聲混勻，冷卻至室溫(25℃)；尼爾雌醇片(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：15020302)。

1.3 主要儀器

三點力學生物儀，上海能共實業(yè)有限公司，DMS 雙能 X 線骨密度儀(型號：starosDR)。

1.4 動物造模

除Sham組外，其余組均采用如下所述造模方法：全程嚴格按照無菌操作進行，術(shù)前禁食8 h，不禁水。配制2%戊巴比妥鈉溶液(40 m/kg)，提捏大鼠后頸部肌肉，伸直右側(cè)大腿，肌注麻醉后，術(shù)區(qū)被皮、碘伏消毒，切口部位選取大腿根部向上1.5 cm 處，用手術(shù)刀片切開表皮、肌肉等組織，找到淡粉色卵巢，牽出淡粉色卵巢，結(jié)扎卵巢與子宮結(jié)合部，剪去卵巢。術(shù)區(qū)用碘伏消毒后，分籠飼養(yǎng)，暖光燈照射，維持大鼠體溫，自由攝取食物與水，密切觀察大鼠情況。術(shù)后切口邊緣注射青霉素20萬單位抗菌消炎。Sham組僅取卵巢旁1 cm3大小脂肪組織進行切除，不進行結(jié)扎輸卵管與切除卵巢等操作，其余處置同上。

1.5 動物分組與給藥

60只大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為Sham組、OVX組、E2組、“強筋健骨方”低、中、高劑量組(JGG、JGZ、JGD)。造模后，Sham、OVX組給予等量生理鹽水，E2組給藥濃度12 μg/(kg·d)，“強筋健骨方”三劑量組(分別相當于成人劑量1、2、3倍)分別給予制備好的“強筋健骨方”水煎液，低中高組給藥濃度分別為5.56 g/(kg·d)、11 g/(kg·d)、22 g/(kg·d)。

1.6 檢測指標

1.6.1BMD測定：定將麻醉后大鼠仰臥位平放于骨密度儀測試臺上，最大程度伸展大鼠股骨，使股骨充分暴露于X線下，打開骨密度儀掃描雙側(cè)股骨，測量骨密度數(shù)值。

1.6.2骨礦含量(bone mineral content，BMC)測定：含量剔出大鼠雙側(cè)側(cè)股骨，清理周圍肌肉組織，干燥箱中(溫度90 ℃)烘干1 h，天平稱重(精確度：0.1 mg)。電爐炭化后置入馬福爐(800 ℃)2 h，待骨灰冷卻后，電子天平稱重。3%硝酸溶液10 L分別加入0.05 g和0.1 g灰質(zhì)，移至25 L的比色管中，室溫下放置48 h，溶液呈無色透明，測試骨礦含量。

1.6.3骨組織形態(tài)學觀察：取股骨用4%多聚甲醛溶液固定，EDTA脫鈣液脫鈣，以長針可刺入為準。流水過夜沖洗股骨，定量濃度乙醇浸泡，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察骨組織形態(tài)。

1.6.4骨生物力學測定：應(yīng)用骨生物力學方法來進行骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究是其中較好的手段，可反映骨的宏觀力學效應(yīng)及骨質(zhì)性能(強度、硬度、韌性等)之間的關(guān)系。目前，骨質(zhì)疏松研究中用來評價長骨生物力學性能的試驗主要是三點彎曲試驗，可以良好地反映骨質(zhì)疏松動物長骨的生物力學變化，而且具有操作方便的優(yōu)點[6]。其中，測定的結(jié)構(gòu)力學指標包括反映骨內(nèi)在性能指標彈性模量(Young modulus)、骨應(yīng)力(Maximum stress)和骨外在性能指標最大負荷(Maximum load)、結(jié)構(gòu)硬度(Stiffness)及能量吸收 (Energy)等[7]。

實驗步驟：實驗采用CTM2050S萬能拉力試驗機，取右股骨全長，放入室溫下的生理鹽水當中浸泡3 h，取出恢復(fù)室溫，兩端用黏膠澆鑄后放在間距為22 mm三點壓縮實驗臺上，標本橫截面短軸的方向與加速度方向一致，最大加載速度2 mm/min，啟動壓力架開關(guān)，待股骨斷裂后計算機得出各生物力學數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果表示為均數(shù)±標準差，SPSS 20.0版軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用t檢驗，不齊采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 強筋健骨方對去勢雌性大鼠各組間BMD及BMC的影響

與OVX組相比，其余組大鼠骨密度差異均有統(tǒng)計學意義，且OVX組BMD值明顯小于其余組(P<0.01)；與E2相比，JGG組差異有統(tǒng)計學意義，且BMD值大于E2組(P<0.01)；“強筋健骨方”三組相比，JGD與JGG差異有統(tǒng)計學意義，且數(shù)值小于JGG組(P<0.01)；與OVX組相比，除JGD組外其余組差異均有統(tǒng)計學意義，且數(shù)值均大于OVX組(P<0.05)；與E2組相比，“強筋健骨方”三組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；“強筋健骨方”三組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠股骨骨密度及骨礦含量的比較

2.2 強筋健骨方對去勢雌性大鼠各組間股骨生物力學比較

骨應(yīng)力、彈性模量為反映骨生物力學較為特異性指標，OVX組與其余組除JGD組外相比，骨應(yīng)力與彈性模量差異均有統(tǒng)計學意義，且數(shù)值均大于OVX組(P<0.05)；E2組與強筋健骨方三劑量組相比，骨應(yīng)力與JGD組差異有統(tǒng)計學意義，且數(shù)值大于JGD組(P<0.01)，彈性模量與JGZ、JGD組相比差異有統(tǒng)計學意義，且數(shù)值大于中低組(P<0.05)；強筋健骨方三組比較，骨應(yīng)力JGG組與JGD組差異有統(tǒng)計學意義，且JGG組大于JGD組(P<0.01)，彈性模量JGG組與其余組比較差異有統(tǒng)計學意義，且數(shù)值大于其余組(P<0.05)。見表2。

2.3 大鼠股骨組織學

將股骨切片光鏡下顯示，Sham組骨小梁排列整齊，骨小梁較為飽滿，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔??；OVX組骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，骨小梁之間間隙變大，連接性變差，骨髓腔變大；E2組遭到破壞骨小梁明顯減少，骨小梁相對飽滿，骨小梁排列整齊，尚可連接成網(wǎng)，髓腔較??；“強筋健骨方”三劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)改善顯著，骨小梁相比OVX組間距縮短，排列整齊，髓腔減小。見圖1。

表2 各組大鼠股骨生物力學性能比較Table 2 Comparison of biomechanics of the femur among the

圖1 各組大鼠股骨HE 染色結(jié)果(10×10)Fig.1 He staining results of the femurs of rats in each group(10×10)

3 討論

據(jù)相關(guān)調(diào)查[8]，中國大陸接近14億的人口中，患有骨質(zhì)疏松癥的人群接近20%(40歲以上)，因OP帶來的骨折、全身性骨痛等問題嚴重影響人們的健康，骨質(zhì)疏松癥在中國古代屬于“骨萎”的范疇。在“未病防變”的思想下，基于“肝主筋”“脾主肉”“腎主骨”理論，以“養(yǎng)肝、健脾、補腎”為根本治法，促使機體達到“筋強、肉實、骨豐”的生理狀態(tài)，從而防治骨質(zhì)疏松癥。本文從“補腎、活血”治法為切入點進行復(fù)方對OP治療作用的研究，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，這類中藥復(fù)方確有促進骨形成，抑制骨吸收，從而起到防治OP的作用[9]。OP的治療除了滋補三臟來化生氣血、強筋健骨之外，還應(yīng)注重活血利氣，以此達到OP的治療目的，一些以活血利氣的復(fù)方在OP大鼠的基因表達方面，確能產(chǎn)生一種或者幾種物質(zhì)(如血管內(nèi)皮生長因子)，在骨組織的生長、發(fā)育與修復(fù)過程中(包括大鼠BMD、VEGF蛋白含量及mRNA表達量)起著重要作用[10]。從而提出了“補臟器以調(diào)氣血，調(diào)氣血以利筋骨，臟腑調(diào)達，筋強骨健”的理論，并將該理論進行深化，研制出治療OP的效方“強筋健骨方”，將其進行實驗研究，并為下一步的臨床研究提供實驗基礎(chǔ)。

本實驗采用PMOP大鼠模型，該種OP動物模型是1969年由Saville建立[11]，是目前研究絕經(jīng)后OP最常見、最可靠的動物模型之一[12]?？偨Y(jié)相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)中藥及復(fù)方具有改善實驗大、小鼠生物力學、骨形成、骨吸收、BMD等指標的作用[13-24]。如蒙海燕等[25]用鹿茸及鹿角膠對去勢大鼠灌胃后發(fā)現(xiàn)大鼠的骨密度、骨礦物含量及骨組織形態(tài)學都有一定程度的改善；韋大文等[26]再用補腎方治療去勢大鼠OP后，大鼠骨組織形態(tài)學如骨松質(zhì)、骨小梁結(jié)構(gòu)等都有了明顯的改善；毛春煥等[27]在用骨松健骨方治療去勢OP大鼠后，大鼠骨小梁數(shù)目增加，骨小梁間隙降低，骨生物力學性能也得到了明顯的提升。

實驗通過三點彎曲試驗、BMD、BMC及骨組織形態(tài)學來探究強筋健骨方對OP模型的骨生物力學的影響。去勢致大鼠OP導(dǎo)致BMD下降，有效骨量降低，骨密質(zhì)變薄，骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞從而導(dǎo)致骨生物力學的改變，容易發(fā)生骨折[28-30]。彈性模量及骨應(yīng)力是骨生物力學性能的綜合體現(xiàn)，與骨骼的長短尺寸關(guān)系較小，可以較為可靠地展現(xiàn)材料的內(nèi)在生物力學特性[31-32]。結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠生物力學性能明顯下降，通過觀察股骨彈性模量及股骨骨應(yīng)力，可反映出OVX組大鼠骨外在的宏觀力學性能明顯減退。與OVX組去勢雌鼠相比較，E2組及強筋健骨方高、中劑量組的最大負荷、彈性模量及骨應(yīng)力均顯著提高，JGD組也有所提高，猜測強筋健骨方在減少骨吸收，促進骨生成的同時，還提高了股骨的生物力學特性，使其不易發(fā)生骨折，并且本實驗還發(fā)現(xiàn)股骨生物力學特性優(yōu)劣與給藥劑量有一定的相關(guān)性。

研究表明[33]，去勢后大鼠血清ER含量減少會使甲狀旁腺功能亢進，進而引發(fā)過多的甲狀旁腺素分泌，致使骨吸收旺盛，骨形成抑制，從而降低BMD，誘發(fā)OP。OVX組BMD、BMC值均小于Sham組與、E2組，說明造模成功，正符合造模PMOP大鼠生理特性。與OVX組相比，JGG、JGZ組BMD與BMC數(shù)值均明顯大于OVX組；與E2相比較，JGG、JGD組BMD均顯著提高，雖然BMD組骨礦含量增高與模型組相比較不具有統(tǒng)計學意義；強筋健骨方三組間比較，JGG組BMD值大于其余兩組。綜合分析，強筋健骨方三組可以顯著提高股骨密度及骨礦含量的作用，且JGG組表現(xiàn)較為優(yōu)越。

實驗結(jié)果顯示強筋健骨方能夠有效增加PMOP大鼠BMD與BMC的作用，并且可以有效改善骨小梁結(jié)構(gòu)、縮小骨小梁及骨髓腔間隙，對恢復(fù)去勢大鼠骨質(zhì)微循環(huán)結(jié)構(gòu)有明顯促進作用，從而提高大鼠股骨生物力學特性，增加骨質(zhì)強度以治療PMOP大鼠。